[发明专利]一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建方法

说明书

本发明公开了一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建方法，所述重组多形汉逊酵母是将人工合成的寨卡病毒蛋白E基因片段导入多形汉逊酵母中，获得表达寨卡病毒蛋白结构的重组菌。所述寨卡病毒结构蛋白E基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明的重组多形汉逊酵母可用来生产重组寨卡病毒结构蛋白E，纯化步骤简单、成本低，工业化生产潜力大。

技术领域

本发明属于基因疫苗工程技术领域，涉及寨卡病毒糖蛋白的多形汉逊酵母表达系统的构建。

背景技术

寨卡病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗病毒特征相似，寨卡病毒为单股正链RNA病毒，基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶酶切而成，包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。和其他黄病毒属病毒类似，寨卡病毒的结构蛋白E(ZKE)高度保守且含有多个中和抗原决定簇。此外，ZKE蛋白是与细胞膜受体结合并与细胞膜融合而使病毒进入细胞的主要蛋白，与病毒的吸附、穿入、致病性、组织嗜性和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。因此，结构蛋白E是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。

多形汉逊酵母属于甲醇型酵母，其作为单细胞低等真核生物，不仅具有易培养、繁殖快、便于遗传操作、能对外源产物进行翻译后加工和修饰及无毒性代谢产物等优点，还具有其特有的耐高温特性。这些优点使多形汉逊酵母表达系统近年来迅速发展成为生物工程领域中备受关注的主要细胞工厂之一。多形汉逊酵母表达系统已经成功用于表达许多药用、工业用蛋白质及酶制剂，如具有诊断和治疗价值的真核生物蛋白，其中一些已得到商业化推广，如水蛭素、乙型肝炎病毒表面抗原B(HBsAg)、人干扰素(IFNa-2a)、胰岛素、青霉素、明胶、尿酸氧化酶、植酸酶。

目前，国内外尚未见到利用多形汉逊酵母宿主表达寨卡病毒结构蛋白E的报道。主要的难点可能在于：受到ZKE蛋白结构影响，宿主细胞的ZKE蛋白表达效率较低甚至不表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明首先提供一种寨卡病毒结构蛋白E的分泌型表达载体，该表达载体表达的目的基因为如SEQ.ID.NO.1所示的寨卡病毒结构蛋白E基因片段。

优选的，所述表达载体选自多克隆位点插入有所述目的基因的pHMOXG-alpha-A质粒载体(也简称为pHMOXG-α-A，Song houhui et al，biotechnology letters，25(23):1999-2006)。

本发明所提供的能表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母，是将含有寨卡病毒结构蛋白E基因片段的重组表达载体(例如使用的骨架载体为上述pHMOXG-alpha-A质粒载体的分泌型表达载体，诱导表达)转化多形汉逊酵母宿主而获得的多形汉逊酵母，其中所述重组表达载体中含有如SEQ.ID.NO.1所示的寨卡病毒结构蛋白E基因片段的核苷酸序列。该寨卡病毒结构蛋白E基因片段的设计来源于寨卡病毒结构蛋白E基因，设计的要点在于：1)去除了寨卡病毒结构蛋白E基因自身的分泌信号肽序列部分，2)同时去除了部分疏水区的编码序列。

多形汉逊酵母为FDA批准的食品级酵母。多形汉逊酵母在进行分泌型表达时，外源蛋白在分泌过程中可完成蛋白信号肽切除、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后加工修饰，使所表达的蛋白质更接近具有生物学活性的天然蛋白质形式，是一种广泛被应用的真核表达系统。本发明所述多形汉逊酵母宿主优选为多形汉逊酵母DL-1(AT26012)。

构建上述重组多形汉逊酵母的方法，包括以下步骤：