[发明专利]一种生态海藻生物刺激素的制备方法

权利要求书

1.一种生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：

1）、制备海藻破碎物：将洗净后的海藻破碎，得到海藻破碎物；

2）、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在60～120℃条件下灭菌5～40min，冷却至27～45℃接入酶，酶解30～60min，海藻破碎物、水和酶的质量比5～30:70～95:0.02～1,得酶解海藻；

3）、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；

4）、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为50～70%，在70～150℃条件下灭菌5～40min，冷却至27～36℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.1～2:98～99.9,在温度为27～36℃，发酵罐中氧气浓度为8～21%，发酵6～144h，在温度为70～150℃条件下灭菌20～40min，冷却至20～40℃,得海藻发酵物；

5）、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3）得到的海藻滤液加入到步骤4）得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为95～99.8:0.2～5，在温度为25～35℃，含氧量为1～8mg/L条件下，发酵1～6天，压滤后所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；

6）、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；

所述海藻是浒苔、海带、马尾藻、裙带和昆布中的一种或任意比例两种以上。

2.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：

a）菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10%的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；

b）融冻法提高细胞的通透性：融冻法至少重复一次，其步骤为：将步骤1）得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；

所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液 1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g;

其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm²灭菌40min。

3.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物，其中溶菌酶按照以下步骤进行：

(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，至少匀质一次，匀质温度为30～60℃，匀质压力为2～40MPa，匀质时间为10～40min，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；

(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为15000～30000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；

(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:3～8，得到吸附后的树脂；

(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.001～0.5mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗

脱液；

(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为2000～10000Da；

(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶；

所述树脂是所述树脂为阳离子交换树脂或大孔吸附树脂；阳离子交换树脂的型号为001*7、732、AmberliteIR-120、Dowex-50、Lewatit-100、Diaion SK-1、AllassionCS、Duolite C-20、SDB-3中的一种或多种，大孔吸附树脂为AB-8、D101、D3520、X-5、NKA-II、NKA-9、S-8、XDA-1、H-20、H-30、H-40中的一种或多种。