[发明专利]一种恒温固相重组杂交方法

说明书

本发明公开一种恒温固相重组杂交方法，所述重组杂交方法包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物‑呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。本发明的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种恒温固相重组杂交方法。

背景技术

杂交技术被广泛应用于实验室研究和医疗诊断中，成功的杂交程序至少部分依赖于所使用的探针处于适当的、精确测量的浓度。当杂交反应处于一种不适当的条件下，不准确的结果包括假阳性或者假阴性会频繁发生。

标准的杂交程序通常包括以下几个步骤：(a)95℃高温使核苷酸探针变性。(b)在冰上激冷以防止探针退火。(c)在温度范围55-62℃过夜杂交(Sambrook and Russell,supra；Ausubel et al.,supra.See also Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology,Vol.24:Hybridization with Nucleic AcidProbes(Elsevier,NY 1993))。典型的杂交反应需要消耗时间以及大量的人工。并且，根据探针序列的不同杂交温度必须优化，前者往往依赖于存在于靶标基因序列的胞嘧啶和鸟嘌呤的百分比。这种温度的优化发生于每种分析用的探针，需要大量的尝试和误差测试。对于实施多重靶点同时杂交检测，这种方法就非常困难。

有鉴于此，发展一种简单可靠、不需要消耗时间和复杂步骤的杂交方法成为必须，这里我们发明了一种新的重组杂交方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种恒温固相重组杂交方法，大幅减少了操作时间、步骤和复杂度，可以在固相表面方便快速地决定靶点核酸是否存在于检测样品中。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种恒温固相重组杂交方法，包括以下步骤：

(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；

(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；

(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；

(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；

(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；

(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；

(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。