[发明专利]一种瓯江彩鲤的基因编辑与过表达操作方法

说明书

本发明涉及生物技术，特别是涉及一种瓯江彩鲤的基因编辑与过表达操作方法。本发明提供一种瓯江彩鲤的选育方法，包括：将适量的瓯江彩鲤的精子与卵子混合，撒入水中；待卵子沉落、粘附至位于水中的培养容器中；取出培养容器，冲洗卵子，保持卵子位于适量的水中；去除未受精的卵子；将受精卵子注射用于抑制tyrp1基因的CRISPR cas9基因编辑系统和/或过表达ASIP基因的Tol2转座系统；培育所得受精卵子；将培育所得幼鱼进行筛选。本发明所提供的对经济鱼类—瓯江彩鲤受精卵进行基因敲除与过表达试验，首次在瓯江彩鲤“大花”体色中对黑色素相关基因成功进行了敲除与过表达操作，繁育出瓯江彩鲤四种体色类型的纯系能够将体色稳定遗传给下一代。

技术领域

本发明涉及生物技术，特别是涉及一种瓯江彩鲤的基因编辑与过表达操作方法。

背景技术

鲤(Cyprinus carpio)是全世界分布最为广泛的淡水鱼类之一，是全球的重要养殖对象。瓯江彩鲤(C.carpio var.color)是鲤的一种体色变异群体，原分布于我国浙江省瓯江流域，因其优美的体色以及上佳的口感而成为一种重要的经济鱼类。相比斑马鱼，瓯江彩鲤的体色更加丰富多样，由黑色、白色、红色组合形成多种体色类型，是研究鱼类体色遗传的良好材料。本实验室通过多年的选育工作，获得了“全红”、“粉玉”、“大花”、“粉花”等不同体色类型的瓯江彩鲤选育系，遗传背景清楚，为瓯江彩鲤实施基因敲除与过表达等遗传操作提供了极佳条件。基因敲除是20世纪80年代发展期的一项遗传工程技术，通过基因敲除，可以了解目标基因的生物学功能。基因敲除经历了从ZFNs、TALENS技术到目前的CRISPR/Cas9技术，其体系在不断完善，特别是CRISPR/Cas9系统的基因敲除技术，当前称为基因编辑技术，可以同时满足高效率、高特异性、低价格的要求，应用广泛，成为解析功能基因作用的重要分子生物学工具和当前生物育种的前沿技术。同基因敲除技术一样，基因过表达技术也是研究基因功能过程中最为直观直接的技术手段之一。1996年，Inagaki等在青鳉鱼的基因组内发现了具有自主活性的Tol2转座子，它可以在基因组内插入和切离，并能改变自身的DNA序列，具有温度耐受性较广、无染色体位置偏好性等特点，是目前脊椎动物转基因中应用最为广泛的转座子。基因敲除与过表达技术广泛应用于细胞和各种模式动物研究中，鲤科鱼类在进化过程中出现基因组加倍现象，使其基因组中包含100条染色体，因而对其基因功能的研究更具挑战性。应用基因编辑与过表达技术对鲤进行基因功能研究，具有时间短，作用快，目标明确等优势。鲤科鱼类相比其他硬骨鱼类具有更多的体色类型，是研究鱼类体色进化的良好材料。所以，对于瓯江彩鲤多种体色类型的选育工作是研究鱼类体色形成机制的重要环节。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种瓯江彩鲤的基因编辑与过表达操作方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种瓯江彩鲤的选育方法，包括：

1)将适量的瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var.color)的精子与卵子混合，撒入水中；

2)待卵子沉落、粘附至位于水中的培养容器中；

3)取出培养容器，冲洗卵子，保持卵子位于适量的水中；

4)去除未受精的卵子；

5)将受精卵子注射用于抑制tyrp1基因(LOC 109085040)的CRISPR cas9基因编辑系统和/或过表达ASIP基因(LOC109082435)的Tol2转座系统；

6)培育所得受精卵子；

7)将培育所得幼鱼进行筛选。

对培育所得的幼鱼进行筛选后，即可获得体色有所变化(例如，变浅或加深)的F0代。

在本发明一些实施方式中，所述瓯江彩鲤为“大花”体色配套系。