[发明专利]一种在T细胞中具有高转录活性的嵌合启动子

说明书

本发明涉及在T细胞中具有高转录活性的嵌合启动子，所述启动子序列由增强子sDTS和与该增强子可操作地连接的启动子组成，其中，所述增强子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述；所述增强子位于所述启动子的5’端或3’端，优选位于5’端。本发明还涉及包含该嵌合启动子的核酸构建体、载体和T细胞。本发明的嵌合启动子能在T细胞内高效表达的启动子，特别适用于驱动外源基因(如全长抗体基因)在T细胞内的高效表达。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种T细胞高活性启动子及其用途。所述启动子为人工合成的嵌合启动子，该启动子在T细胞中具有高活性。本发明还涉及含有该启动子的重组载体、重组病毒、以及所述启动子控制外源基因在转基因T细胞治疗中的用途。

背景技术

人类研究癌症已有百年历史，至今还是无法完全攻克癌症。随着手术治疗、化疗、放疗等治疗方式的出现，癌症患者的生存率已得到极大改善，但这些疗法却不足以挽救全球上千万的癌症患者。随着生物技术的蓬勃发展，生物治疗作为一种新兴的治疗手段应运而生，目前已成为癌症治疗领域的第四大疗法。

生物治疗包括多种模式，如免疫治疗(细胞、细胞因子、抗体和疫苗等)、基因治疗、调节血管生成治疗、小分子靶向药物以及干细胞与组织工程再生医学等。其中，癌症免疫疗法自2013年入选《科学》杂志最值得关注的六大科学领域以来，受到了学术机构、制药公司的广泛关注。

癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫检查点阻断剂等。其中，免疫检查点阻断剂对于很多癌症，尤其是恶性且产生化学药物耐受性癌症的治疗具有明显的效果，已经有4种免疫检查点阻断剂得到了FDA的批准；另外，在过继性细胞治疗领域，特别是新一代CAR-T细胞治疗技术对血液肿瘤包括白血病和淋巴瘤已展现出惊人的治疗效果。目前，CAR-T细胞制备主要基于病毒和非病毒表达体系，而病毒载体很可能导致细胞发生复制和插入诱变继而引起生物安全性问题。2013年MD Anderson癌症中心的Cooper实验室使用一种非病毒转染方法，即睡美人(Sleeping Beauty，SB)转座子系统进行基因修饰获得CD19抗原特异性CAR-T细胞。

启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。

组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。哺乳动物中常用的组成型启动子包括病毒来源：鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子(分别简称mCMV与hCMV)、猴空泡病毒SV40启动子；人基因组天然来源：EF1α启动子、泛素启动子(Ubiquitin，简称Ubi)、β-actin启动子、PGK-1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、eIF4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子、Endothelin-1启动子等。

在肿瘤免疫治疗中，维持外源基因的高效稳定表达非常重要。然而，一些病毒来源的组成型启动子尽管瞬时表达活性较高(如CMV启动子)，但容易因表观遗传修饰而被关闭表达；而一些人源天然组成型启动子或肿瘤特异性启动子虽然表达稳定，但表达活性相对较弱，难以满足免疫治疗需求。因而，研究人员又设计构建了一系列人工嵌合启动子，它们包含了一些顺式调控元件，主要包括能发挥稳定表达作用的启动子核心序列，以及能增强表达效率的上游增强子或下游内含子，代表者是嵌合启动子CAG(包含人CMV增强子-鸡β-actin启动子-兔β-globin内含子)，广泛应用于外源基因的表达。