[发明专利]构建细胞全转录本扩增产物的方法及其应用

说明书

本发明提出了一种构建细胞全转录本扩增产物的方法。该方法包括：将细胞样品进行磁珠捕获处理，以便获得待处理细胞；以及将所述待处理细胞进行单细胞全转录本扩增，以便获得所述待处理细胞的全转录本扩增产物，其中，进行单细胞全转录本扩增之前，进一步包括将所述待处理细胞进行裂解处理，所述裂解处理是通过向所述待处理细胞中加入PBS和裂解液进行的，基于1～100个待处理细胞，所述PBS的用量为7微升，所述裂解液的用量为4微升，所述裂解液包括100mM Tris‑HCl、500mM KCl、25mM MgCl₂、10％NP40、0.1M DTT、RNA酶抑制剂(40U/μl)、0.5μM UP1引物、2.5mM dNTP以及无核酸酶水。该方法将磁珠捕获技术与单细胞全转录本扩增技术巧妙相结合，严格控制待处理细胞与裂解液和PBS的加入量，可稳定获得微量细胞(如循环肿瘤细胞)全转录本扩增产物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及构建细胞全转录本扩增产物的方法及其应用，更具体地，本发明涉及构建细胞全转录本扩增产物的方法、检测细胞中预定因子的方法、检测细胞中预定因子的系统以及检测前列腺癌循环肿瘤细胞中AR-V7的试剂盒。

背景技术

前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内其发病率居男性恶性肿瘤的第2位，死亡率居第5位。近十年来，随着我国人口老龄化和生活方式的改变，前列腺癌的发病率和死亡率呈明显的逐年上升趋势。

雄激素受体(AR)在前列腺癌的发生、发展中起着重要作用，其通过调节下游基因的表达，促进前列腺癌的进展和转移。晚期前列腺癌的治疗方法主要是内分泌治疗，即雄激素剥夺治疗(ADT)。但在前列腺癌的治疗过程中，常常对其产生耐药，并发展成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在CRPC中尽管雄激素水平被抑制，但AR信号通路在CRPC中仍起着至关重要的作用。AR-V7(androgen receptor splice variant 7)是AR-Vs(androgen receptorsplice variants)中的一种，结构类似于AR，但缺乏配体结合域，可以不依赖雄激素而持续地活化。

Antonarakis等人探讨了循环肿瘤细胞(CTC)中AR-V7的表达和CRPC患者对AR靶向疗法的药物恩杂鲁胺或阿比特龙治疗反应之间的相关性。研究结果显示，恩杂鲁胺治疗组39％的患者和阿比特龙组19％的患者出现循环肿瘤细胞中AR-V7阳性。恩杂鲁胺组AR-V7阳性患者与阴性患者相比，PSA(前列腺特异抗原)反应率明显降低(0％VS 53％，P＝0.004)，PSA无进展生存时间(1.4个月VS 6个月，P＜0.001)，临床或影像学无进展生存时间(2.1个月VS 6.1个月)和总体生存时间都明显缩短；阿比特龙组也出现相似的结果(AntonarakisES,Lu C,Wang H,et al.AR-V7and resistance to enzalutamide and abiraterone inprostate cancer[J].N Engl J Med.2014,371(11):1028-1038.)。这说明AR-V7参与了恩杂鲁胺和阿比特龙耐药性的发展。目前已有大量研究证明，对前列腺癌循环肿瘤细胞AR-V7的检测可以对CRPC患者中AR靶向疗法的耐药性进行评估。

因此，如何快速、准确地检测前列腺癌患者中循环肿瘤细胞(CTC)中的AR-V7，是指导前列腺癌患者用药的关键问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。