[发明专利]一种新型金属离子耐受性角蛋白酶及其应用

说明书

本发明为一种新型金属离子耐受性角蛋白酶及其应用，提供了一种基于宏基因组技术挖掘的角蛋白酶及其应用方法，属于工业生物技术领域。该角蛋白酶基因全长1,149bp，编码382个氨基酸；以枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600为例，成功实现了该角蛋白酶基因的异源表达。该角蛋白酶基因的获取方法方便可行，将该基因进行重组表达，构建的重组菌株可以实现重组角蛋白酶的分泌表达，重组角蛋白酶对金属离子和表面活性剂表现出较好的耐受性，酶稳定性较好。重组菌发酵周期短，适合于工业化大规模的生产。另外，该酶具有良好的还原能力，能应用于生物法制备纳米银粒子的研究中，制备得到的纳米银粒子具有良好的形态，并且具有较好的抑菌活性。

技术领域

本发明提供了一种新型金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其在生物法合成纳米银中的应用方法，属于工业生物技术领域。

背景技术

角蛋白酶是能够特异性降解羽毛、羊毛、毛发、指甲等富含角蛋白的特殊的蛋白酶类。其能够降解不溶性的角蛋白而区别于一般的蛋白酶的特性使角蛋白酶能够广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中。我国早期对微生物角蛋白酶的研究主要集中在角蛋白酶产生菌的选育、角蛋白酶的分离纯化和性质研究、角蛋白酶的应用上。2003年，吉林大学的梁斌等人首次成功将来自于地衣芽孢杆菌L-25的角蛋白酶基因进行了分离并且成功在枯草芽孢杆菌中实现了外源表达，自此，角蛋白酶的基因分离表达等分子生物学和基因工程研究开始受到越来越多国内研究者的关注。近几年来，不同来源的角蛋白酶在芽孢杆菌、大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母表达系统中重组角蛋白酶的表达上均取得了一定成功，但是表达水平以及重组角蛋白酶的降解活性并不理想，难以大量用于工业发酵，这也限制了角蛋白酶的工业应用。角蛋白酶早期主要运用于角蛋白废弃物的处理、皮革脱毛、饲料生产、洗涤剂中，近几年来，研究者将目标转向了角蛋白酶应用于管道毛发废弃物的清理，皮肤、指甲相关的药物，个人洗护用品等领域中。印度的一个科研团队从Bacillushalodurans PPKS-2野生菌中纯化获得两个角蛋白酶，发现其中一个具有很高的二硫键还原活性(Applied Microbiology and Biotechnology,2010,87,2:625–633)；表明角蛋白酶具有良好的还原能力。

近年来，随着纳米银制备技术的不断发展，纳米银的应用越来越广泛。银纳米材料具有特殊的物化性质，被广泛用于工业、医药等重要领域。在工业生产中，纳米银与银相比具有更好的催化活力，且加入纳米银后可有效改善产品的光学、热学、磁学等特性。在医药领域，纳米银常作为药物用于疾病的预防和治疗。纳米银粒子的制备方法有物理法、化学法和生物法。物理法包括真空沉积法、球磨法、蒸发冷凝法、等离子法等方法来制备，适用于大规模制备但是对设备要求较高，反应能耗高，产率低。化学法通过化学还原试剂将溶液中的银离子还原为单质银，然后聚集变为纳米级别的银粒子，反应中经常需要引入其它添加剂，如分散剂，稳定剂、保护剂等。这些添加剂中不乏毒性较大、污染严重的有机溶剂，因而不利于所制纳米银的广泛应用，尤其限制了其在医药领域中的应用(CN106180753A)。而生物法合成纳米银，主要通过生物样品中的酶类、蛋白质等物质还原出单质银，并且自身可以作为稳定剂制备得到纳米银粒子，因其方法简单易行、绿色环保、反应条件温和、低成本，以及制备得到的纳米粒子具有良好的生物相容性而受到国内外诸多研究者的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型高金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其生物法合成纳米银的应用方法，属于工业生物技术领域。提供包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，利用该重组菌株表达生产角蛋白酶的方法，以及利用该角蛋白酶生物法合成纳米银的应用方法。

本发明的技术方案是：