[发明专利]一种高背景下沙门氏菌的检测方法

权利要求书

1.一种高背景下沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法将免疫磁珠法和数字PCR法联合使用，用于食物基质中沙门氏菌的分离与检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中免疫磁珠法包括以下步骤：

1)磁珠清洗：用PBS溶液对Ocean的200nm的磁珠进行清洗，磁珠吸取到用BSA溶液封闭的离心管中；

2)抗体稀释：取10μL浓度为1mg/mL，4℃的抗体加入到上述离心管中，用PBS进行稀释，稀释到浓度为0.5mg/mL；

3)磁珠与抗体偶联：取4℃保存40μL的磁珠，加入10μL浓度为1mg/mL的抗体，加入90μLPBS溶液，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠3min，用PBS清洗体系中多余的抗体，清洗两次后，磁珠重悬于100μL链霉亲和素磁珠终浓度为250μg/mL的PBS中，即得到沙门氏菌免疫磁珠，4℃冰箱保存备用；

4)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备所得的沙门氏菌免疫磁珠40μL，与沙门氏菌待测液100μL混合，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠，磁分离时间5min，将富集得到的磁珠-菌体复合物进行后续DNA提取及数字PCR检测。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中所述DNA提取的方法为热裂解法。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述热裂解法的具体步骤包括：取1mL所述的磁珠-菌体复合物于1.5mLEP管，在4℃条件下，以12000r/min离心5min，弃去上清液，再向管中加入1mL ddH2O，12000r/min，5min，4℃，离心，弃去上清液，再加入50μLddH2O、混匀，并置于电热恒温水浴锅中99℃煮沸10min后，立即置冰上20min，然后以12000r/min，4℃离心5min，取上清，-20℃保存，DNA模板提取完成，可用于进一步的检测。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中数字PCR法包括以下步骤：

①配置反应液：将引物、探针、ddPCR supermix配置成22μL反应液，PCR反应液中加入样本DNA 2.2μL，将配置好的ddPCR反应液加入到微滴发生板上，在微滴发生板上加皮套；

所述PCR反应液如下表所示：

②制备微滴：将微滴发生板装放入一个8通道微滴制生成器中，在每个孔中加入70μL微滴生成油来形成微滴；

③PCR扩增：将样本生成的微滴取40μL手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封，然后置于热循环中扩增；

热循环模式如下所示：

95℃ 6min PCR

95℃ 30s

57.6℃ 60s变温速率：2℃/s

加固油滴

98℃ 10min降温

20℃保持变温速率：1℃/s；

④检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；

⑤分析数据、显示结果：采用QuantaSo任软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性，并显示出检测结果。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述上游引物序列Salm-F为5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’，下游引物序列Salm-R为5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’，探针序列Salm-P为5’-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-3’。