[发明专利]一种诱导向胆管细胞分化的方法及其专用培养基

说明书

本发明公开了一种诱导多能干细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。该培养基是在RPMI1640培养基的基础上添加了2.3％(V/V)胎牛血清，2.7％(V/V)B27，0.2mol/L缬氨酸，1％(V/V)青霉素。该诱导分化方法包括以下步骤：1)将表皮形态发生蛋白基因导入进SW86细胞，得到高表达活性表皮形态发生蛋白的SW86细胞；2)将高表达活性表皮形态发生蛋白的SW86细胞作为饲养层并进行生长阻滞处理后接种hPSC细胞，用上述体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的专用培养基在37℃、5％C02下共培养，得到胆管细胞。本发明提供了一条获得胆管细胞的新途径，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及诱导细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导多能干细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。

背景技术

由人多能干细胞(hPSC；包括胚胎干细胞hESC和诱导多能干细胞hiPSs)生成功能性肝细胞的能力将提供肝细胞源，以用于药物代谢研究和用于处理肝脏疾病的基于细胞的疗法。肝细胞是特别重要的，因为它们是负责药物代谢的细胞，并且因此用于身体的异型生物质的消除。鉴于这一作用和个体在他们的代谢特定药物的能力方面可能不同这一事实，从代表性的人群样本获得功能性肝细胞会对制药工业内的药物发现和测试具有巨大的影响。除了提供药物测试的新平台，hPSC源性肝细胞可以为肝病患者提供潜在的新疗法。虽然肝移植为终末期肝病提供了有效的处理，但是可行供体器官的短缺限制了可用此方法处理的患者群。肝细胞移植与用hPSC源性肝细胞开发的生物人工肝的设备代表了用于具有特定类型的肝病的患者的挽救生命的疗法。然而，这些应用依赖于由hPSC生成成熟代谢功能的细胞的能力。由于这样的事实：对控制肝细胞成熟的调节通路了解甚少，所以重现性和有效地生成这种细胞迄今为止具有挑战性。

鉴于功能性人肝细胞的潜在处理和商业上的重要性，已经针对优化由hPSC生成这些细胞作出了显著努力。几乎所有的方法都试图概括分化培养物中的肝发育的关键阶段，包括定形内胚层的诱导，内胚层至肝的命运的特定性，被称为肝细胞的肝祖细胞的生成和成肝细胞至成熟肝细胞的分化。在大多数研究中，以单层格式诱导分化，其中顺序加入已知的通路激动剂和拮抗剂以调节发育的早期阶段，包括内胚层的诱导和肝特化。通过这个策略，已经有可能优化这些早期分化的阶段和生成在定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞中高度富集的种群，定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞由诸如Hex、甲胎蛋白和白蛋白的标记的表达所限定。虽然这些早期分化阶段合理地良好地建立，但是没有描述条件：例如促进肝细胞的成熟至功能性细胞，功能性细胞由阶段I和阶段II药物代谢酶的活性所限定。用不同的方案生成的种群在它们的成熟状态上有很大的不同并且在大多数情况下表示未成熟肝细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行的用于体外诱导多能干细胞向胆管细胞分化的专用培养基。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的专用培养基，是在RPMI1640培养基的基础上添加了2.3％(V/V)胎牛血清，2.7％(V/V)B27，0.2mol/L缬氨酸，1％(V/V)青霉素。

本发明的第二个目的是提供一种体外诱导多能干细胞定向分化为胆管细胞的方法。

本发明所提供的体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的方法，包括以下步骤：

1)将表皮形态发生蛋白(epimorphin，EPM)基因导入进SW86细胞，得到高表达活性表皮形态发生蛋白的SW86细胞；

2)将高表达活性表皮形态发生蛋白的SW86细胞作为饲养层并进行生长阻滞处理后接种hPSC细胞，用上述体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的专用培养基在37℃、5％CO₂下共培养，促使hPSC细胞向胆管细胞分化并形成管腔样结构，得到胆管细胞。