[发明专利]一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备ZnO纳米粒子的方法

权利要求书

1.一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备ZnO纳米粒子的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白

(2)ZnO纳米材料的制备

①重组胶原蛋白与六水合硝酸锌和氢氧化钠均匀混合溶液的配制：

在1ml水中加入15-179mg六水合硝酸锌和胶原蛋白粉末，所述胶原蛋白粉末的加入量大于0、小于等于20mg，混合均匀，缓慢搅拌5-120min后，得到无色透明且均匀的液体：再向该溶液中缓慢滴加氢氧化钠溶液，得到白色的絮状物；

②温和的生物矿化条件下制备纳米级ZnO：

将所得絮状混合物放在20-37℃的恒温箱中，放置1-40天，得到白色沉淀；

③纯化并干燥保存制备的纳米材料：

将产物通过离心分离，离心条件为12000rpm，弃去上清液，留下固体：并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在20-37℃恒温干燥箱中干燥即得；

所述的步骤(1)中重组胶原蛋白由以下步骤制备：

①确定重组胶原蛋白的序列：

重组胶原蛋白的序列为：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；

②合成编码重组胶原蛋白的核酸：

合成编码步骤(1)中第①步的重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；

③重组胶原蛋白的制备与纯化：

取50μL菌液加到100mL含抗生素的LB液体培养基中，恒温摇床过夜进行增菌培养后，转移到1L含抗生素的LB培养基中，在37℃恒温摇床中继续扩增培养；待OD 600值达到0.8-1范围，将摇床温度调为25℃，加入1mM IPTG诱导表达，恒温过夜培养；将菌液在低温离心机中离心，收集菌体；将菌体用A缓冲液溶解，A缓冲液为20mM咪唑，20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH为7.4；利用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声时细菌悬浊液放于冰浴中，以防温度过高导致蛋白变性；将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：14000rpm，4℃，30-50min；收集上清液，即粗蛋白溶液，通过液相色谱进行进一步纯化；后经冻干，得到白色絮状固体；此固体放于-20℃冰箱保存，使用时通过称重法标定浓度。

2.根据权利要求1所述的一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备ZnO纳米粒子的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的胶原蛋白粉末加入量为0.1-5mg，胶原蛋白质量分数为0.01-0.5wt％。

3.根据权利要求1所述的一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备ZnO纳米粒子的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的六水合硝酸锌固体加入量为15-119mg，[Zn²⁺]的浓度分布从0.05到0.4mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备ZnO纳米粒子的方法，其特征在于：步骤(2)中第②步中所述的絮状混合物在25-37℃的恒温箱中，放置1-10天。