[发明专利]基于DNA微阵列技术的病毒检测方法

权利要求书

1.一种基于DNA微阵列技术的病毒检测方法，其特征是：检测方法步骤如下：首先根据流感病毒基因库将其作为对比标准信息存储在计算机系统中，其次对于发病状态下进行临床病毒采样，通过二级实验室进行多组份分离，经过RT-PCR过程后制备成基因芯片，通过激光共聚焦扫描技术进行系统扫描、检测，最后将扫描的图谱与流感病毒基因库进行比对得出结果。

2.根据权利要求1所述的基于DNA微阵列技术的病毒检测方法，其特征是：所述的病毒样本采集方法步骤如下：一、临床体液标本，在没有服用过抗病毒药物前提下，通过鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液提取体液；二、血清标本，在病人的急性期和恢复期期间，采集空腹血，要求双份血清，同时填写监测病例标本原始登记表，采集后应立即放入PH7.4-7.6的Hank’s采样液中，置于4 ℃以下低温保存，采样液包含有蛋白质和抗菌素，其中庆大霉素0.10mg/ml、抗真菌素1.95Ug/ml，标本采集后在24小时内送到2级实验室进行病毒分离，24小时内未能进行病毒分离的标本应放置于-70 ℃或以下。

3.根据权利要求1或2所述的基于DNA微阵列技术的病毒检测方法，其特征是：所述的病毒基因芯片的制备方法步骤如下：首先提取所采集病毒的单链DNA，通过PCR技术经过20次循环的复制过程，获取病毒靶基因片段，生成病毒双链DNA模板，通过对病毒双链DNA模板3轮的扩增过程，产生特定长度片段，再经过内切酶消化、转录获得病毒mRNA，其中特异性引物长度22mer、含量45~55%、引物的浓度为0.23~0.98umol/L，其二将得到的病毒细胞的mRNA再经过反转录，通过RT-PCR过程对cDNA片段进行cy5标记，得到A物质，再将正常细胞的mRNA反转录后，经过RT-PCR过程对cDNA片段进行cy3标记，得到B物质，然后将A物质与B物质进行等量混合、杂交，形成所需要的病毒基因芯片。

4.根据权利要求1或2或3所述的基于DNA微阵列技术的病毒检测方法，其特征是：所述的病毒细胞mRNA反转录的方法步骤如下：首先将病毒mRNA加入逆转录酶，温度控制在35~38℃进行反转录，在温度升高到92~96℃进行变性，此时mRNA被降解，cDNA作为模板，然后以cDNA模板为基础加入耐热taq DNA聚合酶和正向引物进行退火，其中Mg2+浓度控制在1.6~1.9mmol/L，引物浓度控制在0.15~0.45µmol/L，温度控制在53~57℃，在72℃温度下进行延伸，完成PCR的第一个循环，其次将新合成的cDNA链与原有的cDNA链共同作为模板，再重复退火、延伸过程，得到所需的病毒基因片段，以上过程重复20个循环，可以得到1048576个所需的病毒基因片段。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的基于DNA微阵列技术的病毒检测方法，其特征是：利用激光扫描共聚焦显微镜，所述的检测方法步骤如下：采用488nm氩离子激光器作为激发光源，经物镜聚焦，从病毒基因芯片背面入射，聚集于病毒基因芯片与靶分子溶液接触面，杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集，并经滤波片滤波，被光电倍增管在光子计数的模式下接收，转换为数字信号送计算机处理，成像后与流感病毒基因库比对分析。