[发明专利]一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法

权利要求书

1.一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）制备海绵支架材料，并检测其力学特性，然后利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；所述的海绵支架材料的制备具体方法为：首先称取20g鸡、鸭、牛、羊、猪、马等动物皮肤组织，尽量将组织剪成小块，以2%至8%的碳酸钠溶液超声脱脂，控制温度在30℃以下，用纯水洗涤去除残留的碳酸钠；将脱脂后的皮肤用破壁机打碎后再浸泡于500 mL 1M醋酸中，加入1-5g胃蛋白酶消化2-3天，过滤，向粗提液中加入10%氯化钠盐析，充分搅拌后将得到白色胶原沉淀，将白色胶原沉淀复溶于0.5M醋酸溶液中，使用3500KDa的透析袋以纯水为外液透析2-3天，得到胶原液，将胶原液置于玻璃器皿中预冻过夜，然后冻干48h后即可得到海绵支架材料；

（2）将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到步骤（1）中制备的海绵支架材料上，然后在含有10% FBS培养液中培养7天，即制备成三维胶质瘤组织工程化单元，保存备用；其中，所述步骤的具体方法为：将人胶质瘤细胞浓度调整为1x10⁷/mL，制成生物打印墨水，逐滴打印到海绵支架材料上，将海绵支架材料转移到培养箱中待细胞粘附1h后再补加适当的培养液以浸没支架；

（3）检测步骤（2）中制备的三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖GAG分泌量；

（4）采用生物等效性组化方法检测第7天时的生长状态。

2.根据权利要求1一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的胶质瘤的三维支架构建的具体方法为：称取2g海绵复溶于360 mL pH=3的稀盐酸中以得到均匀分散液，加入40 mL 0.5%的纳米纤维素与分散液充分混匀后再利用3D打印技术精确打入孔板内，每孔容量100至600µL，预冻后冻干24 h即可得到2-4mm厚度的海绵支架材料，紫外灭菌2h后即可得到构建胶质瘤的三维组织支架。

3.根据权利要求1所述的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的力学特性检测的具体方法为：取70mL海绵支架材料溶液于长方形模具中预冻后冻干，沿同一方向裁取得到长宽10cm×1.6cm，厚度为3mm的长条形海绵；用力学测试仪器夹住长条形海绵的两端，标准距离为1cm，以5 mm/min的速率进行薄膜和薄片拉伸性能的测定试验。

4.根据权利要求1所述的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：步骤（2）中还包括每2天更换新鲜培养液，观察支架内细胞生长状态。

5.根据权利要求1所述的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体方法为：待三维胶质瘤组织材料培养24h后进行live/dead荧光检测；将培养1天的三维胶质瘤组织材料和浸泡在培养液内1天的无细胞海绵支架材料收集冷冻，并于第7天一起检测第1天和第7天三维胶质瘤组织材料以及无细胞的海绵支架材料的GAG含量，最后通过三维胶质瘤组织材料的GAG含量减去对应的无细胞海绵支架材料的GAG含量，即可得到三维胶质瘤组织在培养第1天和第7天时GAG的分泌量。