[发明专利]一种靶向表观基因调控抗乙型肝炎病毒分子HBx1C及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种靶向表观基因调控对乙型肝炎病毒分子HBx1C及其应用。本发明根据生物信息学及表观遗传工程和免疫学原理，设计具有针对乙肝病毒（HBV）基因靶向特异性亲和作用、且可以对乙型肝炎病毒基因的DNA进行表观甲基化修饰的全新蛋白分子HBx1C基因，通过腺病毒载体导入细胞内，可高效表达出针对HBV病毒靶向特异的蛋白分子，并可对病毒基因产生甲基化化学修饰。体内外实验证实具有高效抑制HBV表面抗原表达的功能，达到抗乙肝病毒的治疗效果，可用于制备表观遗传工程治疗乙型肝炎的药物，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体涉及靶向表观基因调控抗乙型肝炎病毒沉默分子及其应用。

背景技术

中国有大约 3 亿人患有肝脏疾病，主要包括病毒性肝炎 ( 感染乙肝病毒（HBV）的乙型肝炎和感染HCV 的丙型肝炎为主，我国 HBV 感染的乙型肝炎更多见 )、非酒精性脂肪性肝病和酒精性肝病等。肝炎、肝硬化、肝癌对国人的健康和社会经济带来了巨大的挑战。

HBV致病过程中，通常呈现慢性肝炎、肝硬化及肝癌典型的病理进程三步曲，机体可发生染色体和基因序列水平上的突变，包括染色体缺失与重排、非整倍性、基因扩大与突变等传统分子遗传学的变化，HBV 有 A、B、C、D 四个基因型。欧美人以 A、D 型居多，而我国以 B、C 型为主。

核苷（酸）类药物（NAs）是临床最常用的抗 HBV 感染治疗药物，索拉菲尼(Sorafenib) 是第一个用于治疗晚期肝癌的口服药物，其通过抑制细胞内多种丝 / 苏氨酸激酶和酪氨酸激酶 ( 如 B-Raf 和 VEGFR 等 ) 的活性，抑制肿瘤细胞生长和血管生成。但是上述药物在停止用药后会有强烈的反跳现象，造成严重的病理后果甚至死亡。

通过软件预测，3.2 kb的HBV基因组上有3个CpG岛，CG序列较多，且多为基因调控序列，可作为人工甲基化干预的靶序列，可利用DNA甲基化转移酶（DNAmethyltransferase, DNMTs）对HBV的cccDNA进行甲基化修饰调控。

本研究选择亚洲代表基因C型的HBV毒种作为细胞模型和动物模型的病原，针对HBV CpGII的x基因启动子（X P）核心序列设计特异结合的蛋白结构域，与具有催化DNA甲基化酶（Dnmts）的结构域融合，以构建XP靶向DNA甲基化酶HBx1C，采用腺病毒进行包装，通过对HBV XP的靶向甲基化，实现了对HBV病毒表达可持续的抑制（沉默）效应。证实HBx1C具有长达4个月以上的持续特异甲基化修饰的功能，可以用于生产治疗乙肝病毒的基因工程药物。

发明内容

本发明目的是提供一种靶向表观基因调控抗乙型肝炎病毒沉默分子及其应用。

本发明通过对HBV XP的靶向甲基化，期望对HBV病毒表达实现沉默的效应，为乙肝病毒的防治与治疗提供相应的理论基础和技术手段。

本发明一方面，使用生物信息学方法，分析HBV DNA序列CpG和基因启动子间的位置关系，确定可作为甲基化修饰研究的基因启动子；然后采用相应软件，设计并得到具有针对DNA序列特异性识别和结合功能蛋白结构域来介导的甲基化酶的靶向修饰，即识别X基因启动子的特异性结合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.1所示，记为 HBx1C 。

本发明另一方面，提供编码上述识别X基因启动子的特异性结合蛋白HBx1C的DNA，其核苷酸序列为SEQ.ID.No.2所示。并设计相应的可表达的DNA开放阅读框，与表达载体进行融合连接克隆于如腺病毒的表达载体，或慢病毒表达载体，以及其他任何哺乳细胞表达载体。