[发明专利]一种靶向线粒体的ND4融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种靶向线粒体的ND4融合蛋白，从N端至C端分别包含CAG启动子、线粒体靶向序列、ND4和UTR，其中所述线粒体靶向序列为OPA1基因的线粒体靶向序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明公开了编码所述ND4融合蛋白的核苷酸序列、包含所述核酸的表达载体、表达所述的ND4融合蛋白的细胞株、包含所述的ND4融合蛋白的制剂以及所述融合蛋白的制备方法。还公开了ND4融合蛋白和含ND4融合蛋白的制剂在治疗Leber遗传性视神经病变中的应用。OPA1线粒体靶向序列定向引导ND4蛋白进入线粒体，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种靶向线粒体的ND4融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)是一种退行性视力障碍，通常表现为中央视力的双侧丧失。平均发病年龄在20岁中期，通常在数周至数月内没有疼痛，直到双眼视力恶化到0.1以下，严重影响患者的生活质量。LHON是由于线粒体基因突变引起的，与NADH泛醌氧化还原酶、即线粒体呼吸链的复合体I亚基的三个线粒体基因之一的突变有关。研究表明，影响ND1基因的G3460A突变、影响ND6基因的T14484C突变和影响ND4基因的G11778A突变被认为是LHON的主要原因，并且每种突变都具有永久性视力丧失的显著风险。所有这些都与视网膜神经节细胞的局灶性退化有关。

两个主要的LHON突变G3460A和T14484C导致患者血小板中分离的线粒体NADH脱氢酶活性降低80％。然而，从G11778A细胞中分离出的线粒体显示复合物I和呼吸链中大多数其他成分的活性接近正常。对中国LHON患者而言，G11778A位点突变患者占90％。在11778位点的突变，使ND4蛋白的精氨酸转变成组氨酸，导致功能障碍、视神经损伤和Leber遗传性视神经病变，其发病率高、预后差。

LHON治疗的主要问题产生于将DNA输送到细胞器的障碍。现有技术CN 102634527B公开了一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法，其大小为2889bp，由COX10的编码28个氨基酸的肽链，引导ND4蛋白进入到线粒体中。CN 104450747 A公开了一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4(ND4)基因全长以及药剂。该基因全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带Cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR组成。将CN 102634527 B的药剂，或CN 104450747 A的含有CAG-Cox10-ND4的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变，该等药剂能够在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白发挥作用。但是，该技术还存在靶向性不高，治疗效果不佳的缺点，还有待改进。目前还没有利用OPA1携带融合蛋白来定位线粒体治疗疾病的报道，而且OPA1比CoX10序列更长靶向性效果更好，OPA1参与细胞内膜的融合，可以准确的将ND4蛋白定位到线粒体内膜上，本研究是首创的采用OPA1-ND4融合蛋白治疗Leber遗传性视神经病变。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中ND4融合蛋白靶向性不高、治疗效果不佳的技术问题，提供一种靶向性ND4蛋白及其制备方法和应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种靶向线粒体的ND4融合蛋白，从N端至C端分别包含CAG启动子、线粒体靶向序列、ND4和UTR，其特征在于，所述线粒体靶向序列为OPA1基因的线粒体靶向序列，所述OPA1基因的线粒体靶向序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述OPA1基因的线粒体靶向序列由序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸编码。

更优选地，所述ND4融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。