[发明专利]用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS71、引物及其应用

说明书

本发明公开一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS71、T_m‑shift引物及其应用。该SNP分子标记ITS71位于SEQ ID NO：1所示的第71位碱基C或T，此处碱基为C的为锡兰钩虫，此处碱基为T的为犬钩虫。基于SNP位点ITS71设计的引物能对锡兰钩虫与犬钩虫进行准确鉴定；两者T_m值的CV分别为0.09％与0.15％；当锡兰钩虫与犬钩虫样品稀释度低至1:10⁷时，仍可对二者进行区分；对10份已知钩虫待检DNA样本的检测结果与已知种完全一致；对临床样品的检出率明显高于镜检，准确率与测序结果完全一致。该技术可用于犬源钩虫的种类鉴别和分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估。

技术领域

本发明属于钩虫病诊断和检测技术领域，具体涉及一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS71、T_m-shift引物及其应用。

背景技术

钩虫(Ancylostome)是呈世界性分布的常见寄生虫，可对犬猫和人的健康造成严重的危害。寄生于犬的钩虫有犬钩虫(Ancylostoma caninum)、锡兰钩虫(A.ceylanicum)、巴西钩虫(A.braziliense)和狭头钩虫(Uncinaria stenocephala)(Chilton and Gasser,1999)。据调查，近年来中国犬感染的钩虫主要为锡兰钩虫和犬钩虫(Liu et al.,2015)。目前，锡兰钩虫在亚洲已成为感染人的第二大类钩虫(Traub,2013)，特别是在东南亚国家，如中国(Chen et al.,2012；Liu et al.,2014)、日本(Kaya et al.,2016)、马来西亚(Nguiet al.,2012)、老挝(Conlan et al.,2012)、泰国(Traub et al.,2008)、印度(Traub etal.,2007)等地。该虫是唯一可在人体内发育为成虫的动物源性钩虫。犬钩虫是分布最为广泛的钩虫种类，在世界范围内均有分布，除感染犬之外，亦可感染人(Bowman et al.,2010)。上述两种钩虫均为人畜共患的寄生虫，能寄生于宿主的消化道，夺取营养，造成肠道出血、贫血，营养不良和皮炎等严重的症状(Hotez et al.,2014；George et al.,2016)。因此，建立犬源锡兰钩虫和犬钩虫快速准确的鉴定方法对该病的防控显得尤为重要。

粪便检查是检测钩虫的传统方法。该方法简便、易行，对于钩虫重度感染具有较好的敏感性，但在轻度感染时容易漏检。由于不同钩虫虫卵形态相似，仅凭外观难以对钩虫进行种类鉴定。目前，分子检测技术已应用于钩虫的鉴别，如特异PCR、多重PCR、限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)(Hu et al.,2015；Liu et al.,2013；Ngui et al.,2012)。但上述技术均存在一定的局限性，如有的无法对大量样品同时进行检测，有的操作繁琐、成本昂贵。

近年来，一种基于单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)的T_m-shift分子检测方法引起了人们关注。该方法无需特异性探针，仅在PCR反应体系中预先加入SYBR GreenⅠ荧光染料，PCR结束后根据熔解曲线中T_m值的差异直接对样品进行分析，即可完成SNP的检测(Wang et al.,2005)。它具有高通量、操作简单、准确、成本低和闭管操作等优点(Zhou et al.,2012)。迄今为止，该方法已在医学、微生物学、水生生物学等多个领域应用(Huang et al.,2015；Derzelle et al.,2011；Ahn et al.,2016)。最近，我们建立了猫源蓝氏贾第虫A型与F型的T_m-shift分型方法，开拓了兽医原虫的基因分型方法(Panet al.,2017)。

发明内容