[发明专利]基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法

说明书

基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法，解决了现有技术中结构光超分辨荧光显微技术依赖于荧光标记，特异性较差，长时间观察样品易发生荧光漂白和光损伤，而拉曼超分辨显微成像技术又基于近场扫描的方式实现，稳定性较差，无法对样品进行全貌性快速成像的技术问题。本发明的成像系统包括结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置。该成像系统将结构光超分辨荧光显微技术与拉曼超分辨显微成像技术相结合，实现非标记的、全貌性的、快速超分辨成像，能用于细胞膜、人工磷脂膜、人工纳米孔、内吞/转运单个分子及颗粒体系、病毒进入细胞机理、活细胞内分子的动态过程、纳米细胞相互作用及生物效应等研究方向。

技术领域

本发明属于微观粒子超分辨成像技术领域，具体涉及一种基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法。

背景技术

在生命科学领域中，围绕活体细胞的超分辨成像一直是仪器开发的热点。近年来，几种远场荧光超分辨显微镜的出现，突破了光学衍射极限，成功地实现了生物样品的超分辨成像。其中，结构光超分辨荧光显微技术(SIM)对样品标记的要求较低，成像速度较快，可以实现活体细胞的超分辨成像。但由于其仍然依赖于荧光标记，特异性较差，长时间观察样品易发生荧光漂白和光损伤。

物质的拉曼散射信息具有“指纹特性”，基于拉曼散射的拉曼超分辨显微成像技术是一种非标记的物质分析方法。拉曼成像技术可对生物样品进行非标记的特异性成像，且能够避免水溶液的干扰，表面增强拉曼技术则可解决拉曼散射信号过于微弱的问题，实现快速成像，可对活体细胞进行实时分析。然而现有的拉曼超分辨显微成像技术多是基于近场扫描的方式实现的，稳定性较差，无法对样品进行全貌性快速成像。

有鉴于此，亟需提供一种特异性强、稳定性好，能够实现非标记的、全貌性的、快速的、超分辨的成像系统。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中结构光超分辨荧光显微技术依赖于荧光标记，特异性较差，长时间观察样品易发生荧光漂白和光损伤，而拉曼超分辨显微成像技术又基于近场扫描的方式实现的，稳定性较差，无法对样品进行全貌性快速成像的技术问题，提供一种基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下：

基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，包括结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置；

所述结构光发生装置包括激光器、激发滤光片、扩束镜组、PBS分束器、半波片、铁电液晶、偏振态调制组件、第一聚焦镜和掩模板；

激光器发出单色激发光，依次经激发滤光片滤光，扩束镜组扩束后，进入PBS分束器分束，S方向的偏振光经过半波片到达铁电液晶，经铁电液晶调制获得具有不同照明方向的衍射光，衍射光经半波片被调制为P方向的偏振光，透射光经过PBS分束器达到偏振态调制组件，经过偏振态调制组件调制为每个照明方向下光的偏振方向都垂直于光束所在的平面，调制后的光束经过第一聚焦镜会聚在掩模板处，生成±1级两束相干光；

所述拉曼散射信号激发装置包括准直镜、第二聚焦镜、长通短反二向色镜、物镜和伴有表面增强拉曼基底的样品；

掩模板生成的±1级两束相干光经准直镜准直后，在一次像面处发生干涉，然后经第二聚焦镜聚焦后到达长通短反二向色镜，反射后进入物镜，在伴有表面增强拉曼基底的样品处激发出的拉曼散射信号，拉曼散射信号经物镜透射后经过长通短反二向色镜，滤掉返回光路中的激发光以及瑞利散射光，得到无干扰的增强型拉曼散射信号；

所述一次性拉曼成像装置包括发射滤光片、反射镜、管镜、搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮和EMCCD，所述搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮的每个中心波长的带通滤光片分别允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过；