[发明专利]一株普鲁卡因单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0718及其应用

说明书

本发明公开了一株普鲁卡因单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0718及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明普鲁卡因完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫(80μg/只)用完全弗氏佐剂，多次加强免疫(50μg/只)用不完全弗氏佐剂，最后一次用普鲁卡因完全抗原(25μg/只，不含佐剂)冲击免疫。取高效价低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对普鲁卡因具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.32ng/mL)，为食品中普鲁卡因残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株普鲁卡因单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0718及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

普鲁卡因又称“奴佛卡因”，是一种白色结晶粉末，易溶于水，其水溶液呈酸性，不稳定，受外界条件影响易水解和氧化而变成黄色，常将其盐酸盐用作临床局部麻醉药。此外，普鲁卡因青霉素作为青霉素的普鲁卡因盐，常用于对青霉素敏感的革兰阳性球菌引起的中度与轻度感染，具有良好的抗菌活性。但普鲁卡因青霉素作为抗生素药物的一种，过度使用会对人类健康带来极大危害，许多国家对动物性食品中普鲁卡因青霉素的含量做出了严格的限制，尤其在乳制品中，我国农业部在第235号兽药残留公告中对奶中普鲁卡因青霉素限量要求≤0.004mg/kg。

普鲁卡因含量的测定可以作为普鲁卡因青霉素含量监测的一种重要手段，而目前普鲁卡因青霉素的测定多依赖于大型仪器，如气相色谱法、液相色谱法等，成本高、时间长、专业性高、难以实现大批量检测。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。

发明内容

本发明的目的是提供一株普鲁卡因单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对普鲁卡因具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立普鲁卡因的免疫学检测方法。

本发明的第一个目的是提供一株单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0718，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14692，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种普鲁卡因单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.14692的普鲁卡因单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0718分泌产生。

所述普鲁卡因单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中普鲁卡因残留的分析检测。

本发明的第三个目的是提供制备所述的普鲁卡因单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0718的方法，基本步骤为：

1)半抗原的合成：

称取适量琥珀酸单甲酯溶解于二氯乙烷中，加入草酰二肼和DMF，在室温下搅拌反应2-4小时，形成体系一；称取适量普鲁卡因和AlCl₃溶于二氯乙烷中，形成体系二；将体系一和体系二混合，在0℃下搅拌反应2天，然后用NaHCO₃调节至碱性，干燥得到中间粗产物A；称取适量粗产物A溶于20-40％的甲醇中，加入LiOH，在室温条件下搅拌反应过夜，加入适量HCl浓缩，通过制备型HPLC纯化粗产物，得到半抗原PRC-HS；

2)完全抗原PRC-HS-KLH的制备：称取适量半抗原PRC-HS，溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入三正丁胺，4℃下搅拌，再加入氯甲酸异丁酯得到A液；取匙孔血蓝蛋白KLH，用硼酸缓冲溶液溶解得到B液，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，4℃下反应过夜，即得偶联物PRC-HS-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；