[发明专利]一种禽流感病毒的全悬浮培养方法

说明书

本发明公开了一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：取EB66细胞进行生长培养；步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。本发明用EB66细胞进行禽流感病毒培养，避免了采用传统鸡胚培养工艺生产时易引入大量杂蛋白的缺点，有效降低鸡只免疫副反应的发生，同时提高培养的禽流感病毒滴度及纯度，进而提高禽流感疫苗的生产品质。

技术领域

本发明涉及一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养禽流感病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

目前，已上市的禽流感疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，国内外应用鸡胚进行禽流感病毒的生产己有许多年的历史。该工艺简单且技术成熟，其制备工艺主要流程为：首先将种毒液接种至鸡胚尿囊液中，鸡胚作为一个卵细胞整体，由于组织分化程度低，不会对接种的病毒产生抗体，十分有利于病毒的复制；病毒在鸡胚中培育一定时间后，通过收集鸡胚尿囊液，得到疫苗制品的中间产品；经超滤离心和浓缩后，需采用环丙内酯或甲醛灭活，再经裂解剂(如TritonX-100等)进行病毒裂解，并纯化HA和NA蛋白，最后根据HA蛋白所占比例来标定疫苗浓度。

鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。首先，合格的鸡胚除了能正常生产禽流感病毒外，还应该是健康鸡群产下的受精卵，例如SPF海兰白鸡；其次，生产中一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周年；再者，为确保鸡群在生长过程中没有感染任何禽流感等相关疾病，必须经过定期检测，同时要严格确保受精卵内不能带有任何病毒。受到这些因素的限制，导致无特定病原体(Spedfic PathogenFree,SPF)的鸡胚产量小、成本高，往往不能满足大批量生产禽流感疫苗的需求。除此之外，鸡胚培养还存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质，而不同质量的鸡胚会对病毒培养产生不同副作用，且鸡胚的来源容易受到禽流感疫情的影响；此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染，己有研究者指出由母体遗传给鸡胚所带来的潜在污染比GMP车间无菌环境中人为操作所带来的污染化率大很多，而这也正是鸡胚培养过程中难以控制的地方。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。

目前采用传代细胞系MDCK细胞作为培养基质生产禽流感病毒疫苗的技术已经越来越趋向于成熟，甚至已经达到了全悬浮大规模生产的水平，MDCK细胞虽可高密度悬浮培养，培养的禽流感病毒滴度可达到鸡胚水平，但是免疫原性与动物副反应一直是使用MDCK细胞生产禽流感病毒疫苗的技术壁垒。与鸡胚相比，同等血凝价时，采用MDCK细胞生产的禽流感病毒免疫鸡体后产生的抗体水平低，副反应严重，且MDCK细胞能在裸鼠中诱导肿瘤产生，存在致瘤的风险，导致疫苗的使用安全性较低，这对于疫苗的安全性来说是一个致命的缺点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供用全悬浮传代细胞系EB66细胞生产禽流感H9亚型病毒的方法，该方法具有生产工艺稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小、质量易控的优点，可显著提高疫苗产量和质量，使用该方法生产出的禽流感疫苗安全性好、免疫效力高。

本发明的目的在于提供一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：

步骤1：取EB66细胞进行生长培养；

步骤2：至EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；

步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。

进一步地，所述步骤2的具体操作方式如下：