[发明专利]一种检测外泌体tRFRNA的方法

说明书

本发明提供了一种用于检测外泌体tRF RNA的方法。本发明所述检测方法，在tRF RNA两端加上接头序列,针对接头序列设计通用预扩增引物可以对所有小RNA进行无差别扩增，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计特异性扩增tRF RNA的引物序列，进行针对tRF RNA的特异性扩增反应。本发明提供的检测方法，可实现外泌体tRF RNA的定量PCR检测，且本检测方法既可以增加PCR检测tRF RNA的灵敏度，又可以通过跨接头设计PCR扩增引物来区分tRF RNA及其前体tRNA。此外，本发明设计的接头序列和引物序列灵敏度高，特异性好。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测外泌体tRF RNA的方法。

背景技术

tRF RNA(tRNA-derived fragments)是一类来源于成熟tRNA或tRNA前体的非编码小RNA分子,长度约16-40nt。通过精确剪切过程产生的tRF RNA可分为两类：tRNA halves(或tiRNA)和tRFs(tRF-5，tRF-3，tRF-1)(图1)。tRF RNA在体内参与多种生理及病理过程：病毒感染、氧化应激、肿瘤、神经退行性疾病、遗传性代谢疾病等。目前大部分文献用检测miRNA的荧光定量PCR的方法来检测tRF RNA.但tRF RNA来源于tRNA,传统的荧光定量PCR无法区分tRF RNA与前体tRNA.

外泌体成分包含蛋白质、miRNAs、tRF RNA、lncRNA、circRNA，可调节多种生理或病理反应，包括肿瘤细胞侵袭与转移、血管生长、免疫应答等。外泌体中的small RNA分子比较稳定,含量相对丰富，是目前外泌体研究的重点。外泌体miRNA与多种肿瘤、心血管疾病、免疫疾病、神经系统疾病的发生、耐药密切相关，同时外泌体miRNA也可以作为肿瘤诊断及预后标志物。目前检测外泌体tRF RNA的方法主要是测序及荧光定量PCR。但由于外泌体中的核算含量远远低于组织、细胞中的丰度，传统定量PCR方法灵敏度、精度不适合于外泌体tRFRNA样本。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种灵敏度高，特异性好检测外泌体tRF RNA的方法。

本发明的一个目的是提供一种检测外泌体tRF RNA的方法，所述方法包括：在tRFRNA两端加上接头序列,针对接头序列和tRF RNA序列设计引物序列，进行扩增反应。

具体的，所述方法还包括：所述在tRF RNA两端加上接头序列后，先要针对所述接头序列设计预扩增引物，进行预扩增反应，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计引物序列，进行扩增反应。

具体的，所述在tRF RNA两端加上接头序列包括：

1)提取待测样品的外泌体RNA；

2)进行3’端加接头序列反应；

3)根据3’端接头序列设计引物，进行3’端引物杂交反应；

4)进行5’端加接头序列反应；

5)进行逆转录反应。

具体的，所述进行扩增反应包括进行实时荧光定量PCR反应。

具体的，所述接头序列包括：序列表中SEQ ID №：1所示3’端接头核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：3所示5’端接头核苷酸序列；

所述序列表中SEQ ID №：1所示3’端接头核苷酸序列还包括：将序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列的第一位核苷酸进行预腺苷化，变为rApp，同时将氨基-NH₂连接在序列的3′末端。