[发明专利]一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7，其特征在于，所述泛素特异性蛋白酶7进行定点突变后，采用带有标记基团的非天然氨基酸进行定点标记；

其中，所述泛素特异性蛋白酶7带有Strep标签；

所述带有标记基团的非天然氨基酸通过tRNA合成酶/tRNA对引入。

2.根据权利要求1所述的泛素特异性蛋白酶7，其特征在于，所述泛素特异性蛋白酶7通过Rosetta gami菌株和/或BL21(DE3)CodonPlus菌株进行表达，优选为BL21(DE3)CodonPlus菌株。

3.根据权利要求1或2所述的泛素特异性蛋白酶7，其特征在于，所述标记基团包括炔基和/或叠氮基；

优选地，所述非天然氨基酸包括对叠氮基苯丙氨酸和/或叠氮基丙氨酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的泛素特异性蛋白酶7，其特征在于，所述定点突变为将泛素蛋白酶7的非活性区域的三连密码子突变为UAG。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的泛素特异性蛋白酶7，其特征在于，所述泛素特异性蛋白酶7还包括组氨酸标签。

6.一种制备如权利要求1-5中任一项所述的泛素特异性蛋白酶7，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将泛素特异性蛋白酶7的非活性区域进行定点突变，同时在泛素特异性蛋白酶7的两端分别引入组氨酸标签和Strep标签；

(2)将步骤(1)得到的泛素特异性蛋白酶7插入至原核表达载体上；

(3)将步骤(2)得到的载体和携带对应突变的tRNA合成酶/tRNA对的质粒转化至表达菌种中，其中所述载体和质粒具有不同的抗性，以便筛选；

(4)将筛选后的菌株加入培养基中进行诱导表达，并加入能被转入tRNA合成酶/tRNA对识别且带有标记所需基团的非天然氨基酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述泛素特异性蛋白酶7的C端引入组氨酸标签，N端引入Strep标签。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述原核表达载体为pET21a；

优选地，步骤(1)所述定点突变为将非活性区域的三连密码子突变为UAG；

优选地，步骤(3)所述表达菌种为BL21(DE3)CodonPlus；

优选地，步骤(4)所述标记基团包括炔基和/或叠氮基；

优选地，步骤(4)所述非天然氨基酸包括对叠氮基苯丙氨酸和/或叠氮基丙氨酸。

9.根据权利6-8中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)在泛素特异性蛋白酶7的非活性区域中进行定点突变，将非活性区域的三连密码子突变为UAG，同时在C端引入组氨酸标签，N端引入Strep标签；

(2)将步骤(1)得到的泛素特异性蛋白酶7插入原核表达载体pET21a；

(3)将步骤(2)得到的载体和携带对应突变的tRNA合成酶/tRNA对的质粒转化至表达菌种BL21(DE3)CodonPlus中，其中所述载体和质粒具有不同的抗性，以便筛选；

(4)将筛选后的菌株加入培养基中进行诱导表达，并加入能被转入的tRNA合成酶/tRNA对识别且带有标记所需基团的非天然氨基酸。

10.一种如权利要求1-5中任一项所述的定点标记的泛素特异性蛋白酶7用于制备体外诊断试剂盒和/或药物。