[发明专利]一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法

说明书

本发明公开了一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，其核苷酸序列是由如SEQ ID NO：1所示的碱基序列与8个简并碱基组成，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，其中8个简并碱基代表8个简并碱基代表：(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录。该茎环引物反转录效率高，荧光定量结果准确。还公开了采用上述茎环引物进行miRNA定量的方法。

技术领域

本发明属于miRNA定量技术领域，具体涉及一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法。

背景技术

miRNA是一段长度约为22nt的单链非编码RNA短核苷酸片段，在生物体内扮演着重要的角色，主要结合到3’-UTR区域干扰基因的表达进而达到调控细胞的增殖，凋亡，分化及参与疾病的发生发展，包括肿瘤、自身免疫性疾病等。因此，miRNA的表达情况分析是科学研究和临床检测中常用的技术手段。然而由于其序列长度太短，常规的荧光定量方法难以实现miRNA的定量，需要使用特定的策略方能进行定量分析。

用来定量miRNA的方法有miRNA芯片技术，核酸杂交，基于TaqMan的荧光定量分析等，这几种方法虽然有利地推动miRNA相关研究的发展，但是其高昂的成本也是一般科研团队难以承受的，尤其是在一些研究刚刚起步，靶标miRNA还未确定的情况下，这些方法不仅费力，而且费钱。基于SYBR的荧光定量PCR法是一种既能提供可靠性又能降低实验成本的miRNA定量技术。反转录是miRNA的定量第一步，通常情况下需要使用一个长的茎环引物来实现miRNA的反转录，之后再像普通的基因定量一样进行荧光定量PCR。传统的特异性茎环引物的优点在于能够精确地、灵敏地检测目的miRNA的表达情况。但是，需要针对每条miRNA设计一种茎环引物，才能进行后续的定量分析。通用型茎环引物，既可以把样品中全部的miRNA转录出来，又可以通过后续的特异性荧光定量引物进行目标miRNA的定量分析，具有高效和低成本的优点，特别适合miRNA的筛选。

然而，目前报道的一些通用型茎环引物存在反转录效率不高的缺点，对于一些低表达量的miRNA则有可能得不到可靠的分析结果，影响了通用型茎环引物的应用，因此有必要对通用型茎环引物进行重新设计，提高miRNA的反转录效率和荧光定量结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，该茎环引物反转录效率高，荧光定量结果准确。

本发明的目的还在于提供采用上述茎环引物进行miRNA定量的方法，该方法成本低、效率高。

本发明的上述第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，其核苷酸序列是由如SEQ ID NO：1所示的碱基序列与8个简并碱基组成，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，其中8个简并碱基代表：(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)。

所述的茎环引物的5’端是由36个碱基构成的茎环结构，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，3’端是由8个简并碱基构成。

本发明中的改进型通用茎环引物，与之前报道的常规的通用型茎环引物相比较，其茎环结构发生了改变，该茎环引物的碱基序列具体为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG(SEQ ID NO：1所示)+8个简并碱基-3’。

采用本发明中的改进型通用茎环引物，能够对序列不同的miRNA使用同一种改进型通用茎环引物(也可以成为反转录引物，以下称RT引物)进行反转录。