[发明专利]一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法

说明书

本发明提供一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，包括如下步骤：1)构建重组病毒质粒pTRV2‑RhPDS；2)制备侵染液；3)使用高压喷枪法和真空渗透法分别侵染月季植株、月季扦插苗和已经生根月季组培苗，后续并检测基因沉默效率；4)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。本发明的有益效果是：提高了VIGS技术体系在月季中的应用效率，为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)，是指携带植物目的基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导内源基因的mRNA发生特异性降解，使该基因发生转录水平后的基因沉默，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与传统遗传转化的方法相比，VIGS技术是一种免去大规模筛选突变体，能够在当代完成目的基因验证，操作简单、适用于植物基因功能分析，成为了功能基因组学研究领域很有吸引力的技术手段之一。

VIGS技术被广泛用于植物的生长发育、抗病虫、代谢调控等相关基因的功能研究中。VIGS技术也被应用于不同类型的植物，如烟草、拟南芥、矮牵牛、番茄、大豆、小麦、草莓等，但多局限在一、二年生的草本植物上，在木本植物方面有较少的应用。由于木本植物本身生理结构特点，植物生长周期较长，造成VIGS技术难以在木本植物中应用。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，本发明提供了一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，实现简单、快速、鉴定月季RhPDS基因。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，包括如下步骤：

1)构建重组病毒质粒pTRV2-RhPDS；

2)利用所述重组质粒pTRV2-RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101，含有pTRV1和pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液，按照1:1混合，制备侵染液；

3)将所述侵染液避光室温静置活化4小时后分别使用高压喷枪法侵染4片复叶的月季植株、使用真空渗透法侵染2片复叶的扦插苗和生根组培苗；

4)将所述步骤3)中侵染后的月季植株和扦插苗经暗处理24小时之后置于常规栽培基质，在植物培养室分别培养60天和30天，将所述步骤3)中侵染后的生根组培苗栽种到生根培养基中进行无菌培养30天；

5)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面对所述步骤4)中培养后的月季植株、扦插苗和组培苗进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。

进一步，步骤1)中构建重组质粒pTRV2-RhPDS的方法为：

步骤一，提取月季的总RNA并进行反转录,得到cDNA；

步骤二，用酶切引物对所述cDNA进行PCR扩增,得到RhPDS基因386bp片段；

步骤三，对所述PCR扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，采用连接酶进行过夜连接，重组质粒转化入大肠杆菌中扩繁，然后提取重组质粒，进行双酶切验证。

进一步，所述步骤二中所述PCR扩增时的引物1的核苷酸序列为序列表中序列2，所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列3。