[发明专利]一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法

权利要求书

1.一种Repair_PSII基因，其序列如SEQ no.1所示。

2.一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备方法，包括以下步骤：

1）重组质粒pSMART2b-Repair_PSII的构建及表达

提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA并反转录为cDNA，通过PCR扩增出Repair_PSII基因；连接、转化及克隆成质粒pMD18-T-Repair_PSII，并通过限制性内切酶BamHI和ClaI以及生物测序鉴定连接情况，同法将粘性端Repair_PSII基因连接至甲病毒复制子载体pSMART2b上；然后将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII转染进293细胞，Western blot鉴定Repair_PSII基因表达情况；

2）重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备

将鉴定和表达正确的重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR用脂质体法转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；向病毒原液中加入1/20体积的α-糜蛋白酶溶液（10 g/L），室温孵育40min将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白以活化病毒；加入1/15体积的抑肽酶aprotinin（10 g/L），室温孵育5 min；取适量激活后的病毒原液感染BHK-21细胞，48小时后收集重组鸡球虫甲病毒颗粒用于摄透射电镜观察和Western blot鉴定Repair_PSII基因的表达情况；

3）重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备方法优化

将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR按照摩尔比1:1.5的共2.5ug共转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；采用先取辅助质粒pSHCAR 2.5ug单转染入293细胞，6小时换液，24小时时再取重组质粒pSMART2b-Repair_PSII 2.5ug单转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；将优化的病毒原液分别感染BHK-21细胞，即得重组鸡球虫甲病毒颗粒。