[发明专利]一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及系统

说明书

本发明公开一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及系统，包括：通过激光源产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；通过贝塞尔光生成元件，分别将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束；将两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；通过带有电子狭缝的探测器收集荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。本发明实现大视场、大景深成像，提升了样本图像成像质量。

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，更具体地，涉及一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及系统。

背景技术

使用一光束薄片从样本侧面激发荧光，在垂直于光片的方向上通过显微物镜与CCD或sCMOS相机来获取照明层面的荧光图像的光片照明显微技术作为一项二十一世纪新兴的前沿成像方法，相比传统的落射荧光显微，具有光毒性小、高时空分辨率、高通量兼备的特点，进而使得对生物体的三维，动态全景观察成为可能。目前光片照明显微术已作为一种成像的新方法，在国际范围内获得了各类研究人员的广泛关注。

光片显微成像系统以它高轴向分辨率、较高通量以及低光漂白等特点，在生物医学成像领域中得到了广泛的关注。与传统荧光显微成像相比，光片荧光显微系统采用了额外的照明光路来产生一层极薄的激光光片。当样本放置于光片工作区域时，仅有薄光片穿过的平面会激发出荧光信号，被与照明光路正交的宽场采集光路收集，形成图像。通过在探测光路方向上即z方向上快速扫描样本或光片即可产生一系列的切面荧光图像序列，再经过堆叠重构出样本的三维结构，因此图像的轴向分辨率由照明光束的宽度即光片的厚度确定。

随着大量应用研究的开展，更多对光片的挑战和问题也被相继提出。首先分辨率和有效视场之间的耦合关系，是常规高斯光片所面临的巨大障碍。换言之，高分辨率和大视场之间的矛盾在高斯光片荧光成像中难以调和。而贝塞尔光束本身具有零衍射，保型性等特点，近年在光片成像中也成为一大热点。贝塞尔光束在获得数微米高轴向分辨率的同时，也可具有长达数毫米的传播长度从而使光片均匀覆盖数毫米的有效视场，可以有效解决高分辨率与大视场难以兼备的经典矛盾。但是，使用贝塞尔光片进行照明时，虽然贝塞尔光束本身具有中心强度高，自恢复效应以及抗散射等特点，但其本身截面呈环状，存在严重的旁瓣效应，在低数值孔径的探测下要想维持大视野并提高轴向分辨率，对贝塞尔光的旁瓣进行有效的抑制将成为不可避免的重点和难点。如能解决上述矛盾，则贝塞尔光束能应用于显微成像领域，特别是适用于各种大型深层厚组织的成像，解决生物医学上实际问题。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于解决使用贝塞尔光片进行照明时，其本身截面呈环状，存在严重的旁瓣效应的技术问题。

为实现上述目的，一方面，本发明提供一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法，包括以下步骤：

通过激光源产生两路准直且强度一致的高斯激光光束；通过贝塞尔光生成元件，分别将两路高斯激光光束转换成两路贝塞尔光束；将所述两路贝塞尔光束对齐，同步投射扫描样本的两侧，激发样本产生荧光；通过带有电子狭缝的探测器收集所述荧光，并对荧光进行曝光成像，以获取样本的图像，所述探测器采用低数值孔径的探测物镜以进行大视场成像，所述两路贝塞尔光束用于在同一视场下增加透射深度，所述电子狭缝的位置与两路贝塞尔光束的中心位置对应，实现大景深的条件下，消除旁瓣效应，其宽度与两路光贝塞尔光束中心主极强直径相匹配。

可选地，该方法还包括以下步骤：移动样本，直到扫描获取完整的样本图像，在所述样本移动的过程中，两路贝塞尔光束和电子狭缝的相对位置保持不变。