[发明专利]一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞的制备方法

说明书

本发明涉及靶向多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法。本发明方法将7个主要KRAS突变抗原表位序列经串联组合而成的新的人工抗原编码序列，克隆到慢病毒表达载体，转染DC，刺激激活CD8+T细胞的增殖和分化，使得最终制备得到的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)具有靶向7个主要KRAS突变抗原表位的特异性。本发明制备的KRAS突变抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，具有靶向特异性强、无副作用和不易引起免疫逃逸等优点，在KRAS突变肿瘤的治疗中具有极大的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术开发与应用研究领域，具体涉及靶向多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法。

背景技术

KRAS属于RAS基因家族重要成员，是细胞内信号传导通路中重要的“分子开关”，在MAPK(RAS-RAF-MEK-ERK)和PI3K(PI3K-AKT-mTOR)信号传导通路中起重要的调控作用，参与一系列基本的生物过程，包括细胞增殖、生存和分化(Jancik et al.，2010)。但当KRAS发生突变时，其不能被水解酶水解失活，而处于持续激活状态，致使下游信号持续转导，从而造成细胞过度生长、增殖，并促发人类多种致死性肿瘤。时至今日，KRAS突变已存在于大约30％的人类癌症中，其中在多个癌症中有常态化趋势，特别是胰腺癌、结直肠癌和肺癌，其突变率分别高达90％、45％和35％。KRAS被激活最常见的方式为基因点突变，多发生在第12、13、61和146号密码子，常见突变位点为12和13号密码子，其中7个突变热点：G12D、G12V、G13D、G12C、G12A、G12S和G12R，依次分别为突变概率最高的热点，占所有KRAS突变的98.5％以上(Prior et al.，2012)。

大量临床结果发现，KRAS突变对多种恶性肿瘤患者预后不利，例如KRAS突变会导致肺癌靶向药物EGFR-TKIs类发生原发耐药，同时也会导致结直肠癌患者对靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗的预后变差。相比于KRAS野生型的患者，KRAS突变的患者生存期明显缩短(Jancik et al.，2010)。

目前已知的RAS基因家族共有三个基因KRAS、NRAS和HRAS在人类肿瘤中存在突变，其中KRAS突变最为常见，约占85％左右。RAS基因突变，已成为目前世界上最难对付的基因突变。RAS作为一个非常重要的原癌基因，其实是一个非常理想的药物靶点。然而，目前针对该基因还没有行之有效的靶向药物。曾经多个RAS靶向药物都相继失败了，相比于EGFR抑制剂已经开发到第四代，RAS到目前为止还没看到有希望的靶向药被批准上市。其中一个最主要原因在于对RAS的功能以及RAS突变致癌的机理目前仍然没有完全阐明清楚，另外想要设计和开发出一种针对所有RAS突变都有效的药物也几乎是不可能的，因此，只能寻找针对特定突变的靶向药物，但这仍将任重而道远。

肿瘤细胞免疫治疗已经成为目前肿瘤治疗研究的热点，并逐渐被认为是一种行之有效的治疗方法。免疫治疗通过触发机体免疫系统，对肿瘤相关抗原(TAAs)产生反应并攻击肿瘤细胞，是肿瘤治疗领域最有前景的治疗方法，成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗策略。