[发明专利]用于环状RNA过表达的DNA框架及其应用

说明书

本发明涉及一种用于环状RNA过表达的DNA框架及其应用，将这种人工合成DNA框架序列插入真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体上，可形成circRNA专用表达载体。本发明涉及的DNA框架序列及其相应表达载体能广泛的应用于各种circRNA的表达，为研究circRNA的功能和机制以及进一步开发基于circRNA的基因治疗药物提供了一个有利的工具。

[技术领域]

本发明涉及用于环状RNA过表达的DNA框架及其应用。

[背景技术]

环状RNA(circular RNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，其不具有传统线性RNA中的5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，而以闭合环状结构存在。研究表明环状RNA主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征。对于circRNA与疾病的研究表明circRNA与肿瘤、神经发育、动脉粥样硬化、强直性肌营养不良等疾病的发生和进展相关。另外，研究发现在人唾液和血液中能够检测到稳定的circRNA的存在，这些特点使得环状RNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。

目前对于circRNA的研究尚不深入，circRNA在生物功能和调控机制仍然不甚明了。虽然已有的研究认为，circRNA可以作为“sponge”海绵吸附细胞内的microRNA，阻断microRNA对其靶基因的抑制作用；circRNA还可以通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；此外，研究认为circRNA可能具有与蛋白质结合，调控蛋白的活性等功能。然而，circRNA的生物学活性及其在胞内发挥作用的机制需要深入的研究。

正如常规基因功能和机制研究一样，研究circRNA的生物学功能和机制的一个重要研究手段就是在胞内过表达circRNA，观察其对细胞功能的影响并阐释其参与调控细胞功能的分子机制。那么，要在胞内引入过表达的circRNA就必须有稳定可靠的circRNA过表达工具。目前过表达环状RNA的方法通常以基因组DNA为模板，扩增目的circRNA序列及其上游1000bp和下游200bp的序列，然后将上游800bp的反向互补序列通过PCR拼接的方式插入到下游，然后将得到的完整序列通过酶切连接的方式插入商业化的过表达载体如pCDNA3.1上表达目的circRNA。此种方法不适合用于人工设计的环状RNA的过表达。2014年Liang利用对hsa_circ_0001727的上下游序列研究，优化构建了一个circRNA表达框架，但是该表达框架有局限性，仅对部分内源性circRNA的过表达有效，且过表达效率较低。

[发明内容]

本发明的目的是在于提供一种适用于circRNA表达的DNA序列及其载体，该序列普遍适用于各种circRNA的表达，表达效率高效、稳定；该序列能整合到各种类型的表达载体，能应用于普通真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、腺相关病毒表达、逆转录病毒表达等各种表达体系中；应用含有该序列的载体表达circRNA操作简单易行，易于推广。

为了实现上述目的，发明一种式I序列的用于环状RNA过表达的DNA框架，

US-[N]_n-DS

I

其中，

US为上游序列，如SEQ ID NO.1所示，

DS为下游序列，如SEQ ID NO.2所示，

[N]_n为中间序列，N代表A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸中任意一种，n个相同或者不同的N依次连接形成中间序列。

上述用于环状RNA过表达的DNA框架还具有如下优化结构：