[发明专利]一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，步骤如下：选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。本方法快速简便，特异性强，灵敏度高，可重复性高，该方法在39℃下恒温扩增仅需10分钟，胶体金试纸条检测结果5分钟以内，检测结果肉眼观察，整个反应过程不需要昂贵实验仪器，只需一个恒温仪器，可以应用于偏远、资源贫乏地区和现场检测。该方法有望成为简易的常规检测手段，对保证食品安全有重要意义。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及针对单增李斯特菌的恒温扩增快速检测技术，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用。

背景技术

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)广泛存在于自然界中，易污染肉类、奶类、海产品和蔬菜等，由于其易形成生物被膜，使它在食品中存活更长的时间。世界卫生组织在有关食物中毒报告中指出4％一8％的海产品、5％一10％的奶及制品和30％以上的肉制品存在单增李斯特菌污染。而且，由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖，使潜在的危害性进一步增大。食用被单增李斯特菌污染的食物除了会出现恶心、败血、腹泻等一般细菌性食物中毒症状外，还会导致心肌炎、脑膜炎、肠胃炎和肺炎等。在1986年WHO和FDA设立了李斯特菌研究中心，专门协调该菌的病原学、流行学及临床等研究工作，该菌已被列为90年代四大食品致病菌之一。在欧美、日本由单增李斯特菌造成的临床疾病和食物污染问题，在细菌性食物中毒中占第一位。因此现在世界各国都把单增李斯特菌列为食品卫生的法定检测项目。

目前单增李斯特菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。细菌分离鉴定工作量大，成本较低，但检测周期长，灵敏度低；免疫学方法易交叉污染，假阳性严重，灵敏度偏低；分子生物学方法应用最广泛的是PCR，但操作繁琐耗时，必须依赖昂贵的实验设备，不便于在基层或现场检测进行推广。

近年来，重组酶聚合酶(RPA)方法受到关注，该方法是一种新型核酸扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。可在恒温条件下(37℃～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，被认为是最接近所谓的“等温扩增”，具有广阔的应用前景。胶体金试纸条(LF)最大的特点是快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉且不需要专业人员和仪器设备，通常几分钟内就可用肉眼观察到的检测结果。

通过检索，尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用，该方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，步骤如下：

选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。

而且，所述引物对为：

正向引物的核苷酸序列SEQ1：GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG；

反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA。

而且，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin标记。