[发明专利]一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、包被缓冲液、洗液、封闭液、牛PON1单克隆抗体、牛PON1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、显色液和终止液。ELISA检测方法包括以下步骤：包被、封闭、加样、添加捕获抗体、显色和终止。该检测方法采用抗体技术制备牛PON1蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体，以制备的牛PON1多克隆抗体为包被抗体，制备的牛PON1单克隆抗体为捕获抗体，从而建立牛PON1的双抗夹心ELISA检测方法，其检测结果准确可靠，可为诊断牛脂肪肝和酮病提供依据。

技术领域

本发明属于ELISA检测方法技术领域，具体涉及一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

对氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)是动物循环脂蛋白中高密度脂肪酸和低密度脂肪酸的抗氧化蛋白，防止脂肪酸进入细胞被氧化或脂化，防止脂肪酸被氧化后沉积于血管壁而形成血管阻塞。该酶主要由脂肪细胞、肝细胞和肾脏组织合成，然后被释放入血循环，结合在毛细血管内皮细胞表面的高密度脂肪酸上，或储存于脂肪组织中。PON1在脂蛋白的抗氧化过程和能量代谢方面发挥着重要作用，PON1缺乏或活性下降会引起脂代谢障碍。

脂肪肝是反刍动物围产期的主要营养代谢病，在我国一直处于高发状态。迄今为止，牛脂肪肝诊断的金标准依然是肝脏活体穿刺，存在多个弊端，不宜用于快速检测。因此，建立牛脂肪肝的一种快速、准确、实用的监测和诊断方法已成为现代集约化牛场急需解决的问题。酮病也是牛围产期常见的危害较为严重的营养代谢病，其临床主要表现为酮血症、酮尿症和酮乳症。现阶段对于酮病的检查有酮粉，血酮仪等方法，酮粉不能精确检测，存在弊端。血酮仪检测成本高昂，不宜操作。另外，由于牛脂肪肝和酮病都与机体能量代谢障碍有关，二者常相伴发生，牛脂肪肝不仅有酮病的症状，而且症状重，危害更大，故常将二者合称为“酮病-脂肪肝综合征”。因此，需要建立一种既快速，准确，性价比高，又能同时检测脂肪肝和酮病的检测方法。牛PON1活性与肝脂沉积程度成负相关，当肝脏损伤时，肝脏合成PON1减少，血中PON1活性会下降。牛血中PON1含量或活性的降低可作为牛酮病及脂肪肝的诊断指标。鉴于国内目前尚无牛专用的PON1的双抗夹心ELISA检测方法。因此，提供一种可同时诊断牛脂肪肝和酮病的牛PON1的检测方法是亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法，该检测方法采用抗体技术制备牛PON1蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体，以制备的牛PON1多克隆抗体为包被抗体，制备的牛PON1单克隆抗体为捕获抗体，从而建立牛PON1的双抗夹心ELISA检测方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、包被缓冲液、洗液、封闭液、牛PON1单克隆抗体、牛PON1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、显色液和终止液。

进一步地，包被缓冲液为0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸缓冲液；显色液为TMB显色液；终止液为3mol/L的H₂SO₄溶液。

进一步地，洗液由吐温-20与浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液按体积比为1:2000混合配制而成。

进一步地，封闭液是用1×PBS溶液稀释脱脂奶粉，使其浓度为5％，制得。

进一步地，牛PON1单克隆抗体通过以下方法制备得到：采用纯化的牛PON1蛋白免疫鼠，得到达到要求效价的血清，并将其与杂交瘤细胞进行融合后，经过四次克隆筛选出的阳性细胞株，将细胞株注入鼠腹腔，经大量培养后收集，纯化，制得。

进一步地，牛PON1多克隆抗体通过以下方法制备得到：采用纯化的牛PON1蛋白免疫兔，得到达到要求效价的多抗血清，然后进行纯化，制得。