[发明专利]用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法

说明书

用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球，包括磁球，在磁球外包裹有一层金，在金上固定有多肽，所述的多肽的序列特征是：能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，碳末端的5个氨基酸是PPPPC。用于蛋白酶检测的比色检测法，采用上述的多肽功能化磁球，包括以下步骤：A：多肽功能化的磁球的制备：将多肽加入到金包裹的磁球中，磁力分离，用二次水洗涤再加入巯基己醇溶液，得到多肽功能化的磁球；B：蛋白酶的检测。本方法具有简单灵敏、直观、高通量、不需要特殊仪器等优点，该技术的研制成功将实现不同类型蛋白酶的检测。

技术领域

本发明涉及蛋白酶检测，特备涉及一种用于蛋白酶检测的多肽功能化的磁球及检测方法，属于化学领域。

背景技术

蛋白酶能够水解蛋白质或多肽中的肽键。它在消化吸收、创口愈合、功能免疫等方面具有决定性作用。一些重大疾病的发生与蛋白酶的含量和活性变化密切相关，例如，癌症、细胞凋亡、阿尔茨海默病、艾滋病等等。因此，蛋白酶检测在这些重大疾病的诊断和治疗研究等方面具有重要意义。目前用于检测蛋白酶的方法主要有高效液相色谱、凝胶色谱、质谱、荧光光谱和电化学等，但高效液相色谱、凝胶色谱、质谱需要特殊的仪器、灵敏度较低、分析成本较高。荧光光谱和电化学法往往需要对酶基底（通常是多肽）两端进行标记、耗时耗力；此外，多肽两端被标记后有可能会影响酶催化切割的效率。介于蛋白切割反应在研究生命活动及疾病防治中的重大作用，建立一种低成本、简单快速、适于在一般实验室或临床中监控蛋白酶含量或活性变化的方法是当前研究的热点之一。

可视化检测分析法是利用被测溶液本身的颜色（或加入试剂后呈现的颜色），用眼睛(或目测比色计)观察、比较溶液颜色深度，或用光电比色计进行测量以确定溶液中被测物质浓度的方法。这种方法具有分析成本低、检测速度快、不需要特殊仪器等优点，适用于高通量分析。金纳米粒子具有较高的摩尔吸光吸收，近年来，基于金纳米粒子颜色变化的比色分析在金属离子、蛋白质、核酸和生物小分子的检测、药物筛选和环境监控等方面表现出了广阔的应用前景。具有特定序列的多肽在被蛋白酶切割前（或后），可以引起金纳米粒子团聚而变色，基于这一原理可以实现蛋白酶的比色分析。然而，这种检测方法往往需要对多肽序列进行精心设计，例如，在多肽序列中同时引入特定的氨基酸（如半胱氨酸和带正电荷的氨基酸等）。然而，半胱氨酸容易被氧化、且容易和蛋白酶中的二硫键反应而影响蛋白酶的活性。此外，生物基质样品中的一些成分（比如核酸、蛋白质、巯基化合物、无机盐等）容易吸附到金纳米粒子表面，从而影响金纳米粒子的稳定性，对多肽诱导金纳米粒子颜色变化的实验具有较大的干扰性；一些生物基质样品（如血液）自身的颜色和紫外吸收也严重影响了蛋白酶的可视化检测。因此，开发一种简单灵敏、抗干扰能力强、高通量的比色分析方法，用于蛋白酶可视化分析检测是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服目前的蛋白酶检测中存在的上述问题，提供一种用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法。

为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球，包括磁球，在磁球外包裹有一层金，在金上固定有多肽，所述的多肽的序列特征是：能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，碳末端的5个氨基酸是PPPPC。

用于蛋白酶检测的比色检测法，采用上述的多肽功能化磁球，包括以下步骤：

A：多肽功能化的磁球的制备：将多肽加入到金包裹的磁球中，所述的多肽的序列特征是：能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，碳末端的5个氨基酸是PPPPC，混合震荡4-6小时，磁力分离，用二次水洗涤再加入巯基己醇溶液，继续震荡一段时间后磁力分离，用乙醇洗涤，得到多肽功能化的磁球；