[发明专利]一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法

说明书

本发明公开了一种循环肿瘤DNA（以下简称ctDNA）低频突变的检测方法。该方法包括以下步骤：S1，从血浆中提取cfDNA；S2，对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”；S3，对末端修复产物进行接头连接，该接头含有随机分子标签序列，同时含有用于区分不同样本的index序列；S4，对接头连接产物进行PCR扩增；S5，探针捕获目的文库；S6，通过illumina Miseq、illumina Nextseq、illumina Hiseq平台进行测序，并对下机数据进行分析。该方法适用于探针靶向捕获测序，能够降低下机数据重复率，去除PCR及测序过程中产生的错误，提高ctDNA检测灵敏度和特异性，降低假阳性率。

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法。

背景技术

cfDNA是指以单链或双链DNA或DNA蛋白复合物形式存在于血液、脑脊液中的一种胞外DNA。1948年，Mandel和Metais首次发现人体血液中存在游离DNA。在肿瘤患者体内，由肿瘤细胞坏死、凋亡后释放入血液中的游离DNA片段称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。ctDNA片段大小一般为160-180bp左右，半衰期为16min-2h不等。

由于ctDNA携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现，因此，ctDNA相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点，具有广泛前景。

虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。首先，血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，而ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有0.1%-10%。所以，低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。其次，在高通量测序文库构建和探针捕获过程中要进行PCR反应，而PCR过程不可避免地会引入错配碱基，即使是高保真酶，其碱基错配率仍在10^-6左右，并且扩增循环数越多，错误率越高。此外，目前最常用的测序仪Hiseq和Nextseq在测序过程中产生的单碱基错误率在0.01%-1%之间。因此，PCR和测序过程中产生的错误会对低频ctDNA突变检测产生强烈的背景噪音，当模板突变频率低于0.1%时，很难区分模板突变和PCR或测序过程产生的错误，导致检测特异性降低。为了提高检测灵敏度和特异性，目前最常见的做法则是提高测序深度，但由于起始cfDNA模板量量少，在后续实验过程中需要增加扩增循环数，导致下机数据重复率过高，不仅浪费了数据量，增加了成本，检测限也并没有相应地成比例提高。

为了解决这一问题，学者们发明了一种cSMART检测技术，在每一条起始cfDNA模板3’端加上带有分子标签的测序接头，再针对特异性检测位点设计PCR下游引物，上游引物则为与测序接头相同的序列，通过多重PCR方法直接获得目的文库，在后续下机数据分析时可通过聚类分析除去PCR和测序过程中产生的错误，节约了数据量，并且使检测灵敏度达到0.03%。但该方法最大不足则在于其原理为多重PCR建库，因此只能对少量区域或位点进行检测，检测范围远远少于探针捕获测序技术。此外，目前通用的分子标签是由ATCG四种碱基随机组合而成，长度一般8-12bp，理论上四种碱基完全随机分布，但实际在引物合成过程中，由于四种碱基合成所需能量和合成效率不同，导致每个位置出现ATCG的频率并不完全一样。可能会出现连续多个相同碱基的情况，例如8个A或C，从而使实际得到的分子标签数量少于理论值。并且，连续多个相同的碱基还会增加测序错误的可能性，增加优势分子序列的比例。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法，旨在提高现有探针捕获测序法检测ctDNA低频突变的灵敏度和特异性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。