[发明专利]一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达人血清白蛋白的基因工程菌，其特征在于，其是在巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子为AOX1启动子；

所述的α引导肽来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

和/或，所述的表达载体带有抗遗传霉素基因，所述的基因工程菌具有抗0.25～5.0mg/mL浓度的遗传霉素的性能。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

和/或，所述的表达载体的骨架为质粒pPIC9K。

4.一种表达载体，其特征在于，其依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的启动子为AOX1启动子；

所述的α引导肽来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

所述的表达载体的骨架为质粒pPIC9K；

所述的表达载体带有抗性基因；所述抗性基因优选遗传霉素；

和/或，所述人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

6.一种如权利要求1～3任一项所述的表达人血清白蛋白的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)构建权利要求4或5所述的表达载体；

(2)将步骤(1)所得表达载体转化至巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中；

(3)将步骤(2)所得的巴斯德毕赤氏酵母涂布于含有抗性基因筛选标记的抗生素的平板中培养后挑选平板上的转化子即得。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的转化为电转化，所述电转化的电势优选0.75～1.5Kv/cm，更优选1.0Kv/cm；

步骤(3)中所述的抗生素为遗传霉素，遗传霉素的浓度为0.25～5.0mg/mL；

步骤(3)中所述的平板为YPD平板；

和/或，步骤(3)中所述培养的条件为22～30℃，培养24～144小时；优选28℃，培养96小时。

8.一种人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括将权利要求1～3任一项所述的基因工程菌接种于巴斯德毕赤氏酵母菌培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的培养基含有BMGY或者BMMY；所述BMGY或者所述BMMY占摇瓶总体积百分比优选10-30％，更优选20％。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养的过程中，每12～24小时添加体积分数为0.5～2.0％的甲醇，添加4～8次；优选每12小时添加体积分数为1.0％的甲醇，添加8次。