[发明专利]牛双芽巴贝斯虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法

说明书

一种牛双芽巴贝斯虫的Real‑time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法，以双芽巴贝斯虫的18s rRNA基因作为目标基因，该序列高度保守，PCR容易扩增，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，针对B.bigemina的18s rRNA为靶基因的特异性区域，结合其它巴贝斯虫18s rRNA基因的相关信息，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测，应用前景广阔，可以准确、快速的判断牛是否感染了牛双芽巴贝斯虫。

技术领域

本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种牛双芽巴贝斯虫的Real- timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与Real-time PCR检测方法。

背景技术

牛双芽巴贝斯虫是一类经蜱传播，红细胞内寄生的血液原虫，由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病，是一种急性过程的季节性疾病，在世界上许多地区发生和流行，我国各地也常有发生，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后，常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状，严重影响牛的健康。该病已经造成了巨大的经济损失，并呈世界范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。牛双芽巴贝斯虫是经蜱传播的一种血液原虫，寄生于哺乳动物红细胞、淋巴细胞和其他细胞中，也可以寄生在蜱的各种组织细胞中。双芽巴贝斯虫寄生于黄牛、奶牛、水牛和瘤牛的红细胞内，由微小牛蜱(Boop-hilusmicroplus)、无色牛蜱(B.decoloratus)、环形牛蜱(B.annulatus)等多种蜱，经卵传播。双芽巴贝斯虫的临床诊断最基本的方法是血液涂片镜检，但是该方法只能用于对发病牛的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难，因为发病牛只痊愈后很难查到虫体。血清学检查也是牛双芽巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。敏感性更高的方法，例如常规PCR检测技术也是诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点-低特异性，扩增时容易产生假阳性。而且在检测牛双芽巴贝斯虫的过程中发现，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性和特异性更高的方法，例如反向线性斑点杂交技术(RBL)以及PCR-ELISA等也已经见诸于报道，但是这些方法都存在假阳性率高的缺点。

Real-time PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR过程，与常规PCR相比，具有特异性更强、敏感性更高、有效解决 PCR污染、自动化程度高等特点。因其需要的取样量少、快速简便等优点，实时荧光PCR检测技术已广泛应用于病原体检测。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种牛双芽巴贝斯虫的 TaqMan-BHQ Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQ Real-time PCR检测方法，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测，应用前景广阔。

本发明采用的技术解决方案是：一种牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQ Real-timePCR特异性引物和探针，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成DNA片段，具体为：

引物F：5′-TCA-GCG-ACT-ACG-TCC-ATT-TG-C-3′；

引物R：5′-AAT-CAA-CTT-GGC-AGG-GTC-AT-3′`；

探针P：5＇-HEX-CCG-CGT-ACA-AGA-GGT-GAT-ACA-GGA-A-BHQ-3′。

一种牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR检测试剂盒，所述的 TaqMan-BHQ Real-time PCR检测试剂盒包括以下组分：