[发明专利]以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒

说明书

本发明公开一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。因所制得的重组李蛋白rLi protein具有比抗体分子更高的稳定性、特异性和亲合力，其溶解状态4℃放置一年以上，仍然保持完整的抗原结合能力，对肿瘤细胞抗原的识别更加灵敏。本发明具有检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉等优点。

技术领域

本发明涉及一种肿瘤检测试剂盒，尤其是一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒。

背景技术

肿瘤标志物己经有很多种，常见的肿瘤标志物分为糖类抗原、胚胎抗原、细胞角蛋白、肿瘤相关的酶及激素、天然自身抗原等等，有些肿瘤标志物对不同类型的癌症检测具有广谱性，有些则对特定类型的肿瘤具有高灵敏性及特异性。例如：甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、胰胚胎抗原（pancreatic oncofetal antigen,POA）、糖类抗原（carbohydrate antigen, CA、乳腺癌标志物CA153及胃癌标志物CA724等均是现在较为常见的肿瘤标记物。

以七鳃鳗为代表的无颌类脊椎动物，是现存具有适应性免疫系统最古老的物种，其独特的特异性抗原受体和白细胞表面抗原等为重要的免疫分子。近年来大量实验数据表明，七鳃鳗李氏小体是免疫防御系统中最重要的免疫器官，尤其是在适应性免疫系统中发挥重要作用。在七鳃鳗免疫小体的研究中，已发现了一种细胞毒作用的蛋白，并命名为七鳃鳗李蛋白（Li protein），七鳃鳗李蛋白（Li protein ）作为无颌类脊椎动物适应性免疫系统的核心免疫分子，具有特异性识别并结合外来抗原的功能。生物信息学分析表明七鳃鳗李蛋白cDNA全长共1120 bp，共有两个功能域，位于N端的Jacalin_like domain和位于C端的Aerolysin domain，空间结构主要以β折叠片层组成，相对分子质量在34kDa左右，可以利用基因工程菌实现原核表达，生产成本低，适合大规模工业化生产。但是，迄今为止还没有关于将七鳃鳗李蛋白（Li protein）替代捕获试剂及检测试剂应用于肿瘤检测试剂盒的相关报道。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒。

本发明的技术解决方案是：一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，其特征在于：所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。

所述可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白按如下方法制备：

（1）七鳃鳗重组李蛋白rLi protein的诱导表达

①以1μL pColdⅠ-rLi protein质粒DNA转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板；

②挑选阳性克隆，接种至10 mL含有Amp＋的LB培养基中37℃、120 rpm震荡培养过夜；

③次日按上述培养菌液/含有Amp＋的LB培养基以体积比1:100比例接种，37℃、180rpm震荡培养；

④至培养基中菌生长达到对数生长期，即OD600 为0.4 ~ 0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG，15℃、100 rpm 诱导24 h；

⑤菌液7000 rpm离心4℃、15 min，收集上清，得到重组蛋白rLi protein；

（2）重组蛋白rLi protein的纯化

①将收集的上清液用0.45 μm滤膜过滤，用于蛋白纯化；