[发明专利]一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法

说明书

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法，该方法以保藏编号为CGMCC No.11626的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株，采用体积比为20:1的甲醇和山梨醇进行诱导发酵，能够进一步提高GOD产量，下罐酶活达到905U/mL。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中 的高密度发酵方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD,EC1.1.3.4)可催化β～D～葡萄糖氧 化为δ～D～葡萄糖酸和过氧化氢，其作用表现在除葡萄糖，除氧，形成过氧化 氢等方面。葡萄糖氧化酶作为一种天然的生物催化剂，安全、无毒副作用， 在食品饮料工业、畜禽养殖业、医药行业等领域中有众多应用，并且已经取 得了可观的商业价值。GOD用于面包、牛奶、果汁、啤酒等领域去氧保鲜效 果良好；在动物饲料中添加的GOD能具有抗氧化的功能，能显著抑制霉变微 生物的产生，对霉变饲料毒素也有很好的降解作用，从而提高动物免疫能力， 来代替药物促生长剂发挥作用；葡萄糖氧化酶在医药行业中，可以制备成尿 糖、血糖试纸，因其具有操作简单、无害、无毒、容易控制等优点，现在在 临床上具有广泛的应用。

GOD的大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉菌发酵，但黑曲霉和青霉菌发 酵生产GOD过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂蛋白的存在给 纯化带来相当大的困难。因此，通过构建工程菌实现葡萄糖氧化酶的高效表 达，研制及生产高品质的GOD制剂，是一条比较经济有效的途径。

毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白 表达系统，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功表达。近些年，毕赤 酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe)，为其在食品 及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、 培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强 且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基 因的表达。重组葡萄糖氧化酶基因进行毕赤酵母异源表达可有效地解决纯化 困难的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵 方法，进一步提高葡萄糖氧化酶的酶活及产量。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法，以葡 萄糖氧化酶基因GOD转化的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株，其保藏编号为 CGMCCNo.11626，包括如下步骤：

用质量浓度为28％的氨水调节发酵培养基的pH值为4.5～5.0，将活化的 菌种扩培液接入所述发酵培养基中，在28～30℃下通气搅拌18～24h进行发酵 处理；

在所述发酵处理的过程中，当碳源消耗完溶氧量迅速上升时，流加补料 培养基直至发酵液的OD₆₀₀值为150～200；

当碳源消耗完，发酵液的溶氧量再度升高至50％以上时，开始流加诱导 培养基进行诱导发酵；所述诱导培养基含有体积比为20:1的甲醇和山梨醇， 每升所述甲醇中还含有12～14mL的PTM1；所述诱导发酵的条件为：发酵温 度为28℃，发酵液pH值为6.5，维持整个诱导过程中甲醇的终浓度在0.3％， 溶氧量始终为0；在所述诱导发酵的过程中每隔24h加维生素C，使发酵液中 维生素C的终浓度为70～90μg/L，在诱导72h时一次性加入维生素B2，使发 酵液中微生素B2的终浓度为0.8～1.2mM。

优选的，所述发酵培养基为BSM培养基，每升发酵培养基中还含有 4～4.5mLPTM1。

优选的，所述补料培养基中含有质量体积浓度为50％的甘油，每升所述 甘油中还含有10～14mL的PTM1。