[发明专利]一种HPLC-ELSD检测阿维拉霉素预混剂的方法

说明书

本发明提供了一种HPLC‑ELSD检测阿维拉霉素预混剂有关物质的方法，包括以下步骤：制备阿维拉霉素对照品溶液和样品溶液、绘制标准曲线、采用HPLC‑ELSD进行检测、记录峰面积、采用标准曲线法计算样品中阿维拉霉素各组分峰及杂质峰的含量。本方法在公告方法的基础上进行了改进，浸提溶剂由丙酮改为甲醇，降低了毒性和挥发性；样品处理步骤简化，效率更高；梯度洗脱条件优化后各峰之间的分离度提高，各成分计算更加准确，且流动相不需调pH值，节省时间，减少操作失误的可能性；检测器由紫外检测器改为通用型蒸发光散射检测器，检测范围更大，对杂质的监控更全面，更严格。

技术领域

本发明属于成分检测领域，涉及检测阿维拉霉素有关物质的方法，具体的涉及一种HPLC-ELSD检测阿维拉霉素预混剂有关物质的方法。

背景技术

阿维拉霉素是由绿色产色链霉菌Streptomyces viridochromogenes发酵产生的，属于寡糖类抗生素。其组分有A到N共14种组分，其中阿维拉霉素A为主要组分，其生理活性最高，对梭菌、链球菌和杆菌的抑制效果特别高。其次为阿维拉霉素B。

中华人民共和国农业部公告第2253号发布的阿维拉霉素预混剂质量标准对各组分的要求如下：阿维拉霉素A峰应不低于60％，阿维拉霉素B峰应不高于18％，阿维拉霉素A+B应不低于70％，其他单一组分不得过6％。可见质量标准对“其他单一组分”的要求是最严格的。

“其他单一组分”既包括阿维拉霉素次要组分，也包括相关杂质。公告发布的有关物质检测方法为高效液相色谱-紫外检测法，要求杂质在选定的波长下(286nm)有紫外吸收方能检出，这在一定程度上有漏检杂质的风险。

蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器，消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，它不同于紫外和荧光检测器，响应不依赖于样品的光学特性，不受其官能团的影响，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，包括没有紫外吸收的物质。ELSD的响应值与样品的质量成正比，对所有样品的检测几乎具有相同的响应因子，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。示差检测器(RI)也是一种通用型检测器，但灵敏度低，并与梯度洗脱不相容。质谱是另一种通用型检测器，但昂贵的费用和操作复杂性限制了它的应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种通用型检测方法，能尽量多地检测出样品中所含杂质，有效监测各组分含量以严格控制产品质量。为此将ELSD的独特检测能力与HPLC的梯度洗脱分离能力相结合，并在原梯度条件基础上进一步优化提高分离度，用于阿维拉霉素预混剂的有关物质检测。

本发明为实现其目的采用的技术方案是，一种HPLC-ELSD检测阿维拉霉素预混剂的方法，包括以下步骤：

a、制备阿维拉霉素对照品溶液和样品溶液；

b、标准曲线绘制：将3-5份不同浓度的对照品溶液分别注入HPLC-ELSD进行测定，洗脱方式为梯度洗脱，记录对照品色谱图和峰面积；以A组分峰面积的对数值与相应A组分浓度值的对数进行线性回归；

c、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并以b步骤所得线性回归方程分别计算样品溶液色谱图中A、B组分及杂质的含量百分比。

进一步地，HPLC-ELSD进行测定的色谱条件如下：

色谱柱：C185.0μm4.6*250mm；

柱温：30-40℃；

进样量：10-50μL；

流速：0.9-1.1mL/min；

漂移管温度：115-130℃；

增益系数：1；

气体流速：2.0-2.8L/min；