[发明专利]一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法

说明书

本发明公开了一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法。包括：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体‑酶标他克莫司复合物的指示试剂；上述酶标他克莫司由他克莫司和葡萄糖脱氢酶偶联而成。本发明的他克莫司免疫检测试剂可以精确快速地确定人体血液等样品中他克莫司含量。与市场上现有的检测试剂相比，本发明检测试剂具有方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，有利于临床的推广使用。

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体是一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法。

背景技术

他克莫司又名FK506，是80年代从土壤真菌肉汤中提取的钙调酶抑制剂，属于大环内酯类免疫抑制剂，其免疫抑制作用强于环孢素A的10-100倍，主要通过抑制T淋巴细胞的活化与增殖，发挥强大的抑制免疫作用。FK506是器官移植，特别是肾脏移植患者的常用药物，移植后合理服用他克莫司可使器官免遭排斥。此外，FK506现还逐渐应用于一些自身免疫性疾病的治疗，如原发性或继发性肾小球疾病等。但是，剂量过高又会引起严重的副反应，包括肾脏毒性，肝脏毒性和其他一系列的并发症。通过检测病人全血中的FK506的浓度，结合其它临床指征来合理用药，是确保器官移植接受者获得免疫抑制的最有效方法。

目前检测他克莫司的常用方法有：高效液相色谱分析（HPLC）、液相色谱质谱联用法（LC-MS）和荧光偏振法等。其中，HPLC和LC-MS都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，准确性较差；荧光偏振法，检测结果准确性差，对样品的纯度要求较高，还需要昂贵的试剂和仪器设备。

本发明采用的方法为均相酶免疫检测法，其优点为：操作简便、快速、灵敏度高、准确性好、适合于自动化，应用广泛，并且用全自动生化分析仪对小分子物质和大分子物质都能高通量快速测定。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中他克莫司检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、准确检测出待测样本中他克莫司含量的他克莫司均相酶免疫检测试剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂；上述酶标他克莫司由他克莫司和葡萄糖脱氢酶偶联而成。

作为本发明进一步的方案，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。

作为本发明进一步的方案，所述的一种他克莫司免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物的制备：葡萄糖脱氢酶（GDH）与他克莫司偶联，纯化偶联的酶标抗原；

（2）他克莫司均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂1的制备：由他克莫司抗体和均相酶底物混合而成；

试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。

作为本发明进一步的方案，所述的一种他克莫司免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：

1）葡萄糖脱氢酶（GDH）与他克莫司的偶联

a. 将20-100 mg他克莫司溶于甲醇中，加入无水乙酸钠，溶解混匀后加入羧甲基羟胺，溶解混匀，氮气保护下加温反应过夜，然后减压蒸馏得蜡状物，加入二甲基甲酰胺溶解，过滤去除沉淀，减压蒸馏去除溶剂得产物A；

b. 用20-100 mL二甲基甲酰胺溶解10-50 mg产物A，再将50-150 μL的碳二亚胺（EDC）在搅拌下缓慢滴加到上述溶液中，旋转混合60-150分钟；