[发明专利]一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法。本发明提供一种雷公藤的遗传转化的方法，包括如下步骤：采用基因枪法将含有目的基因的质粒导入雷公藤悬浮细胞；所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：1‑3μg/μl；轰击次数：2‑3次；目标距离：3‑6cm；轰击压力：1100‑1350psi；真空度：26‑28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养时间为36‑48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为氯化钙或亚精胺。本发明提供的方法可以提高雷公藤遗传转化率，对于雷公藤的遗传转化研究有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是卫矛科植物，为木质藤本，又名断肠草、黄藤根，在我国主要分布于长江流域以南及西南地区。作为传统中药，其味辛、苦，性寒，具有活血化瘀、清热解毒、消肿散结、杀虫止血等功效。临床上被广泛用于治疗类风湿关节炎、肾小球肾炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病及各种皮肤病，成为国内外研究的热点天然药物之一。

迄今为止已从雷公藤中分离鉴定天然化合物多为萜类和生物碱。雷公藤甲素是主要活性成分之一，它是一类独特的松香烷型二萜化合物，研究发现雷公藤甲素具有明显的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等重要生物活性，成为国内外研究人员的关注热点，并进入临床评价研究阶段。雷公藤红素作为主要的三萜化合物，研究发现其通过抑制癌细胞的蛋白酶活性而诱发癌细胞死亡，有效率达到65％～93％，超过紫杉醇。近期有报道表明雷公藤红素是一个瘦素敏感剂，可能会成为有效治疗肥胖的新型药物。

目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和基因枪法。农杆菌介导转化存在诸多难题，如：雷公藤作为木本植物易木质化、再生困难、需分离更有效的农杆菌菌株，以上问题导致农杆菌转化周期长(6-12月)且转化率低。基因枪转化法是借助高速运动的金属微粒使附着于其表面的核酸分子穿过受体的细胞壁，释放出的DNA分子随机整合到基因组中，通过细胞和组织培养再生植株。基因枪法受体类型广泛；操作简便快速；一次处理可使许多细胞转化。目前应用基因枪法已获得了烟草、拟南芥、大豆等转基因植株或细胞，但在雷公藤中未有报道。然而基因枪法转化率也受到诸多因素影响，比如：受体材料的类型、材料状态、接受和整合外源DNA的能力、转化参数等。因此在基因枪转化过程中，应综合考虑以上影响因素以便有效提高基因枪的转化效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法。

本发明提供一种雷公藤的遗传转化的方法，包括如下步骤：采用基因枪法将含有目的基因的质粒导入雷公藤悬浮细胞；所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：1-3μg/μl；轰击次数：2-3次；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为36-48h。

所述基因枪法中，所述基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：2μg/μl；轰击次数：3次；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为48h。

所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：1-3μg/μl；轰击次数：2-3次；目标距离：3-6cm；轰击压力：1100-1350psi；真空度：26-28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为36-48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为沉淀剂A和/或沉淀剂B；所述沉淀剂A为氯化钙或氯化钙溶液；所述沉淀剂B为亚精胺或亚精胺溶液。

所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：2μg/μl；轰击次数：3次；目标距离：3cm；轰击压力：1100psi；真空度：28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为氯化钙或氯化钙溶液。