[发明专利]一种用于点突变检测的回形LNA探针及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，提供一种用于点突变检测的回形LNA探针及其应用，该探针为一段长度为25~30bp的寡核苷酸；该寡核苷酸的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，在中间的一个碱基上做LNA标记。本发明适用于单碱基突变检测，设计简单有效，适用于市面上主流的检测平台；提高突变检测特异性，对药物基因多态性检测结果更加准确，提高药物治疗效果；提高突变检测灵敏度，为肿瘤药物的伴随诊断及疗效检测提供解决方案。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于点突变检测的回形LNA探针及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应 (PCR) 技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上应用越来越广泛。实时荧光PCR检测技术中应用最广泛的是标记荧光的核酸探针，例如5'-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标等。

随着分子诊断产业的发展，已经从早期的病原体检测、单靶基因检测发展到了多靶基因检测，肿瘤基因突变检测等方面。伴随着精准医疗概念的提出和发展，药物基因多态性检测、肿瘤基因突变伴随诊断检测试剂为代表的单碱基突变检测试剂成为了时下最热门的分子诊断试剂类型。单碱基突变检测方法有ARMS-PCR、MGB探针、LNA探针等方法，而这些方法在应用中很难完全消除野生型模板对突变型的干扰，造成一定程度的假阳性扩增。造成检测特异性不够、突变检测灵敏度不高的情况，难以满足现阶段临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于点突变检测的回形LNA探针及其应用，解决了检测特异性不够、突变检测灵敏度不高的情况，难以满足现阶段临床需求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于点突变检测的回形LNA探针，该探针为一段长度为25~30bp的寡核苷酸；该寡核苷酸的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，在中间的一个碱基上做LNA标记。

具体的，所述的探针为一段与待测靶基因互补的长度为25~30bp的寡核苷酸，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团；5’端6~8个碱基和探针中间段互补，包含单碱基突变位点。结构如图1，在探针游离于反应体系中时，探针自身5’端与中间位置互补形成环形结构。

所述回形LNA探针在单碱基突变检测中的应用，用于点突变检测时，探针覆盖点突变位置，且突变位置处于探针的中间，在探针上点突变位置的碱基上做LNA标记。

在检测突变模板时，探针结合到模板上；由于探针序列与模板序列完全匹配，探针二级结构完全打开，在扩增的过程中Taq酶从5’端将探针水解，发出荧光信号。

在检测野生模板时，探针结合到模板上；由于探针中标记LNA的碱基和野生模板不匹配，探针二级机构不能完全打开，扩增时Taq酶无法水解探针，Taq酶没有内切酶活性，不会发出荧光信号。

当体系中存在突变模板时，探针通过碱基互补配对的方式完全匹配于模板序列上，探针自身二级结构打开，结构如图2。这时，引物延伸到探针位置时根据Taq酶的外切酶活性，从5’端开始水解探针，使发光基团与淬灭基团分开，从而发出荧光。

当体系中只存在野生模板时，由于在探针中点突变位点碱基与模板碱基不匹配，而探针中的这个位点做了LNA标记，导致探针自身环状互补的稳定性远大于探针与野生模板的匹配，探针结构如图3。这时，引物延伸到探针位置时，由于探针5’端没能与模板结合，Taq不能将探针水解，发光基团与淬灭基团没有分开，无法检测到荧光。

根据探针的这种特性，能够将突变模板和野生模板区分开来。