[发明专利]一种桦树花粉主要致敏蛋白Bet v 8的提取和分离纯化方法及应用

说明书

本发明提供了一种桦树花粉主要致敏蛋白Bet v 8的提取和分离纯化方法及应用。所述Bet v 8的提取方法包括使用pH 4.5的醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉致敏蛋白进行提取，所述的分离纯化方法包括先制备桦树花粉水溶蛋白提取液，随后通过阳离子交换层析和Con A琼脂糖凝胶4B层析进一步分离纯化，最终获得纯化的主要致敏蛋白Bet v 8。本发明所制备的提取液或纯化蛋白可用于患者血清样品中主要致敏蛋白的检测，同时还可进一步制备成过敏原检测试剂或脱敏制剂，在提高桦树花粉的皮试阳性率及脱敏疗效方面具有广泛应用。

技术领域

本发明涉及蛋白的分离纯化方法及应用，具体涉及桦树花粉主要致敏蛋白Bet v8的分离纯化方法及应用。

背景技术

过敏是由机体对通常无害的大分子(如蛋白质)物质的免疫反应所引起的。工业化国家中超过25％的人口患有I型过敏并且数量增在稳定增加，桦树花粉症是I型过敏反应的非常常见的形式。在中国，桦树花粉是北方地区春季主要致敏花粉之一(叶世泰，中国气候致敏花粉调查，1991)。

目前已命名的桦树花粉致敏蛋白有7种，分别为Bet v 1、Bet v 2、Bet v3、Bet v4、Bet v 6、Bet v 7、Bet v 8，其中Bet v 1是桦树花粉的主要过敏蛋白，在不同地区的人群中，Bet v 1可以被62-98％桦树过敏患者血清所识别(Moverare R et al,Int ArchAllergy Immunol,2002,128(4):325-35；Sekerkova A et al,Int Arch AllergyImmunol,2011,154(4):278-85)，更多关于Bet v 1过敏原、其异构过敏原和变体的信息，详见于www.allergen.org。

然而，自Ipsen等从桦树花粉中分离出分子量为17kDa的主要致敏蛋白Bet v 1以来，对于桦树花粉过敏蛋白的研究，也主要集中Bet v 1上，有关其基因编码序列、氨基酸序列、蛋白质三维结构以及与各种同源变应原间的交叉反应性现已有大量文献报道。但是，对于桦树花粉中其他的主要致敏蛋白的鉴定和分离纯化，现有技术中并未给出具体报道。

发明内容

本发明的主要目的是鉴定了桦树花粉中另一主要致敏蛋白Bet v 8，并提供了针对上述Bet v 8蛋白的提取和分离纯化方法。

本发明中Bet v 8蛋白的提取方法，其特征在于，包括以pH为4.5的醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉Bet v 8蛋白进行提取；优选地，所述醋酸盐缓冲液为醋酸钠。

本发明中Bet v8蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包含了以下步骤：

1)桦树花粉水溶蛋白提取液的制备；

2)阳离子交换层析，包括将上述步骤1)所制备的桦树花粉水溶蛋白提取液上样之后，首先使用结合缓冲液进行冲洗，随后固定结合缓冲液并逐渐增加洗脱缓冲液的浓度进行洗脱，收集洗脱液第1个洗脱峰；其中结合缓冲液为pH为4.5的醋酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH为4.5的醋酸钠缓冲液和NaCl溶液。

3)Con A琼脂糖凝胶4B层析，包括将上述步骤2)制备的含有目的蛋白的洗脱液上样之后，先使用结合缓冲液冲洗柱子，随后使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液第1个洗脱峰；其中结合缓冲液的成分为Tris HCl，NaCl，MnCl2，CaCl2，pH 7.4；洗脱缓冲液的成分为：甲基-α-D-吡喃葡糖苷，Tris-HCl，NaCl，pH 7.4。

进一步的，本发明中涉及的桦树花粉水溶蛋白提取液的制备可以采用本领域常规的方法进行提取，优选地，本发明使用pH为4.5醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉水溶蛋白进行提取。