[发明专利]H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用

说明书

本发明公开了一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用。本发明首先公开了一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株，其微生物保藏编号为CGMCC No.14740。本发明进一步公开了所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株在制备预防猪流感的疫苗中的应用。本发明还公开了一种预防猪流感的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株和药学上可接受的佐剂。本发明所述细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株具有良好的免疫原性，能对猪提供良好的免疫保护，可作为H3N2亚型猪流感防控的候选疫苗株。

技术领域

本发明涉及一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株，还涉及所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株制备的灭活疫苗及在预防猪流感中的应用，属于H3N2亚型猪流感病毒的分离及应用领域。

背景技术

猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。该病传染性强、发病率高，其临床症状表现为咳嗽、喷嚏、流涕、体温升高、呼吸困难和食欲下降、延迟出栏等。单纯感染死亡率不高，但会对猪的生长性能造成不良的影响；与其他病原混合感染，会使病情加重，死亡率增高，给养猪业造成严重经济损失，是危害中国养猪业较为严重的传染病之一。在中国猪群中，H3N2亚型猪流感病毒是最主要流行的猪流感之一。

对于H3N2亚型猪流感的防控尚无特别有效的手段，主要通过免疫接种进行预防。目前所研制并已商品化的主要是由鸡胚繁殖、辅以佐剂的H1和H3亚型单价或双价灭活疫苗。这类疫苗可以刺激机体产生IgG，对于阻止病毒感染和减轻临床症状十分重要，其保护率高、安全性好，无毒力返强的危险。但由于其采用鸡胚进行疫苗制备，不仅生产成本比较昂贵，还需要处理鸡胚废弃物，存在散毒的危险，因此用细胞进行疫苗的制备将更加廉价和安全。另外，SIV灭活疫苗需要克服异源保护力差、流行毒株抗原性更新快等问题，制备的疫苗需要流行的毒株来进行及时更新，以保证灭活效果。因此，进行现地流行株的分离、细胞适应株的筛选，对于H3N2亚型猪流感的有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株制备的灭活疫苗及其在预防猪流感中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从黑龙江某猪场疑似猪流感发病的猪鼻拭子和肺脏组织中，分离得到一株猪流感病毒。血清学鉴定结果表明，该毒株样品仅能被H3亚型特异性血清中和，确定该毒株为H3亚型猪流感病毒。本发明利用猪流感H1、H3、N1和N2的分型鉴定引物对分离的病毒进行RT-PCR鉴定，结果仅H3和N2两对引物扩增出与预期扩增大小一致的片段。

本发明将分离的猪流感病毒进行3轮蚀斑克隆纯化，纯化后将分离的毒株命名为猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株。本发明对纯化的病毒进行红细胞凝集价和病毒含量的测定，结果猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株的红细胞凝集价为1:1024，病毒含量为10^7.50EID₅₀/mL。

本发明将纯化的猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株接种MDCK细胞进行大量细胞适应性培养，当传代至第6代时，病毒的红细胞凝集价逐渐稳定，为1:256，获得了一株细胞适应株。本发明将上述猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株细胞适应株接种于MDCK细胞，对培养条件进行优化，结果当病毒接种量为1％、吸附时间为1.5h、TPCK-胰酶的终浓度为2.5μg/ml、血清浓度为1％的条件下获得病毒液的红细胞凝集价最高，为1:512。