[发明专利]伪狂犬病毒犬科动物分离株及其制备的灭活疫苗和应用

说明书

本发明公开了一株伪狂犬病毒犬科动物分离株及其制备的灭活疫苗和应用。本发明首先公开了一株伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV‑LN株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14736。本发明进一步公开了所述PRV‑LN株在制备预防伪狂犬病，尤其是预防犬科动物伪狂犬病的疫苗中的应用。本发明还公开了一种预防犬科动物伪狂犬病的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的PRV‑LN株和药学上可接受的佐剂。本发明利用伪狂犬病毒PRV‑LN株制备的灭活疫苗免疫效果良好，能够更好的对犬科动物进行伪狂犬病的防控。本发明分离的伪狂犬病毒PRV‑LN株能够作为犬科动物伪狂犬病防控的候选疫苗株。

技术领域

本发明涉及一株伪狂犬病毒犬科动物分离株，还涉及所述伪狂犬病毒犬科动物分离株制备的灭活疫苗及其在预防犬科动物伪狂犬病中的应用，属于伪狂犬病毒毒株的分离及应用领域。

背景技术

伪狂犬病，又名奥耶斯基氏病，是由伪狂犬病毒引起的一种烈性传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。除各种年龄的猪、牛都易感外，在自然条件下羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐和浣熊等其他家畜及野生哺乳动物均能感染发病，且通常情况下该病毒对这些宿主是致命的，一旦感染死亡率几乎高达100％，给养殖业造成了严重的经济损失。

目前，对于伪狂犬病的防控没有特别有效的防控手段，主要通过接种疫苗来进行。对于猪伪狂犬病的防控，中国市场上主要通过活疫苗和灭活疫苗进行免疫，取得了比较显著的成绩。但对于犬科动物，尤其是规模化的犬、狐和貉养殖业的防控，目前市场上还没有相关的疫苗。这种情况与中国日益扩大的经济动物及皮毛动物养殖业的规模严重不符，因而急需研发一种针对犬科动物的安全性和免疫效果良好的灭活疫苗，以避免对养殖户造成严重的经济损失。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株伪狂犬病毒犬科动物分离株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述伪狂犬病毒犬科动物分离株制备的灭活疫苗及其在预防犬科动物伪狂犬病中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从辽宁省某特种经济动物养殖场采集的发病死亡的狐和貉的脑、肝脏等组织病料中分离得到一株伪狂犬病毒毒株。用伪狂犬病毒gB基因特异性引物对分离株gB基因的PCR鉴定结果表明，PCR扩增出一条200bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致；将PCR产物用Sal I酶切，结果PCR产物可切成140bp和77bp 2个条带。

本发明将分离的伪狂犬病毒经3轮蚀斑克隆纯化后，将分离的伪狂犬毒株命名为PRV-LN株。对纯化的病毒进行病毒效价的测定，按照Reed-Muench法计算结果，PRV-LN株的病毒含量为10^8.17TCID₅₀/0.1mL。

本发明对伪狂犬病毒分离株PRV-LN株TK基因的测序及序列分析结果表明，与大多数的PRV毒株相比，分离株在30位发生了C-G、47位发生了A-G、643位和644位发生了GT-AC和386位发生了A-G的核苷酸的点突变。TK基因的遗传进化分析表明，本发明分离的毒株PRV-LN株位于一个相对独立的分支中。由TK基因推导的氨基酸序列对比发现，分离株PRV-LN株存在以下特征：在16位发生了K-R、129位发生了S-G、214位发生了V-T和284位A-V的突变。

兔体致病力试验结果表明，接种伪狂犬病毒PRV-LN株的兔子，在接种后24-36h注射部位出现奇痒，家兔烦躁、啃咬注射局部，导致皮肤发生溃烂，并全部死亡。证明，本发明分离的狐貉源伪狂犬病毒毒株为强毒株。

本发明将分离的伪狂犬病毒PRV-LN株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14736；分类命名为：猪伪狂犬病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年11月16日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。