[发明专利]一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法

权利要求书

1.一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取梅花鹿瘤胃组织，先将瘤胃内容物用生理盐水清洗干净后，再用含有青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B的PBS缓冲液冲洗6-8遍，最后一遍冲洗后，再加入PBS缓冲液并静止10min；

(2)将瘤胃组织的肌层及上皮层分离，取上皮组织备用；

(3)将上皮组织剪碎，将剪碎的组织均匀平铺在培养瓶中，倒置在培养箱中放置2h；

(4)加入含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B的DMEM/F12培养液中进行贴壁培养；

(5)贴壁培养4天后，弃去培养液，加入含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液，继续培养，每隔4-5天换培养液，所述换培养液操作为保留原培养液的1/3-1/2，加入与弃去培养液体积相同的含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液；细胞铺满培养瓶底部80％以上时的细胞作为第零代细胞；

(6)第零代细胞弃去培养液，用PBS缓冲液冲洗后加入胰蛋白酶进行消化，当在显微镜下观察细胞变圆时，加入与胰蛋白酶等体积的含FBS5-10％(v/v)的DMEM/F12培养液终止消化，将贴壁的细胞吹打成悬液，1000r/min离心5分钟弃上清，加入适量的含有FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液吹打重悬，分成三等分分别补加同样的培养液分别进行培养，在37℃培养箱里静止30min后，将培养液吸出至另一培养皿中，利用上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的方法纯化细胞，此操作重复3次后补加相同的培养液进行培养，可得到纯化的梅花鹿瘤胃上皮细胞；细胞铺满培养瓶底部80％以上时的细胞可进行下一次传代。

2.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(1)所述生理盐水为质量体积分数0.9％(g/mL)的氯化钠溶液。

3.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(1)所述青霉素在PBS中的浓度为700IU/mL，链霉素在PBS中的浓度为700ug/mL，庆大霉素在PBS中的浓度为100ug/mL，两性霉素B在PBS中的浓度为2.5ug/mL。

4.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(1)所述加入PBS缓冲液，加入量为使梅花鹿瘤胃组织完全浸泡在PBS缓冲液中。

5.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(2)所述分离方法为用镊子手工分离。

6.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(3)所述放置条件为37℃，5％(v/v)二氧化碳。

7.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(4)所述DMEM/F12培养液中含有5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL EGF、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/mL胰岛素、5ug/mL转铁蛋白、5ug/mL亚硒酸钠、700IU/mL青霉素、700ug/mL链霉素、100ug/mL庆大霉素、5.0ug/mL两性霉素B；所述培养条件为37℃，5％(v/v)二氧化碳。

8.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(5)或步骤(6)所述DMEM/F12培养液中含有5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL EGF、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/mL胰岛素、5ug/mL转铁蛋白、5ug/mL亚硒酸钠、100IU/mL青霉素、100ug/mL链霉素；步骤(5)或步骤(6)所述培养条件为37℃，5％(v/v)二氧化碳。

9.根据权利要求1所述的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤(6)所述胰蛋白酶浓度为0.25％(g/mL)。