[发明专利]一种建立NK和/或T细胞系的方法

说明书

本发明细胞系的建立方法，公开了一种建立NK和/或T细胞系的方法。所述方法具体为：采集慢性活动性EBV感染患者，或其他与EBV感染相关的淋巴细胞增殖症、淋巴瘤或白血病患者的外周血单个核细胞，在存在细胞因子的条件下，用含有人血清的培养基进行培养。根据本发明所提供的方法，可从少量的外周血单个核细胞培养建立能不断增殖的NK和或T细胞，所获得的细胞系可连续培养3个月以上。本发明所述方法仅需要少量外周血单个核细胞、无需使用昂贵的仪器设备和高浓度的细胞因子，可显著提高建立细胞系的效率。

技术领域

本发明涉及细胞系的建立方法，具体地说，涉及一种建立NK和/或T细胞系的方法。

背景技术

EBV是一种肿瘤病毒，可以潜伏感染B细胞，NK和T细胞(CD4+、CD8+、γδT)等，造成淋巴细胞增殖症。其中NK和T细胞在免疫系统中起重要作用。NK细胞是一种自然杀伤细胞，能以非特异性方式杀伤病原体感染的细胞以及癌细胞，而且可以用酶如穿孔素和颗粒酶杀伤病原体，或通过Fas-FasL相互作用杀伤病原体。不同T细胞在免疫系统中发挥不同功能，有辅助性T细胞和杀伤性T细胞。EBV感染免疫细胞造成淋巴细胞增殖症致病机理尚不清楚，可能是感染的细胞失去杀伤能力，造成疾病，也可能是淋巴细胞增殖造成淋巴瘤和血癌。

疾病来源的细胞系可以作为疾病的细胞模型，是一种重要的工具，用于致病机理科学研究，同时可以用于筛选敏感治疗药物、治疗方法等。建立EBV感染相关的淋巴细胞增殖症、淋巴细胞瘤、白血病等疾病的NK和或T细胞系，主要分为两个步骤，一是淋巴细胞分离，二是NK和T细胞的扩增。根据已有的报道，已有几种建立NK和T细胞系的方法：淋巴瘤和白血病来源单核细胞与鼠基质干细胞共同培养，另外添加细胞因子建立了NK-YS细胞系(Tsuchiyama,J.et al.Blood 1998：92,(4),1374-1383)。用淋巴细胞增殖症(慢性活动性EBV感染)与同源的淋巴母细胞系作为饲养细胞，同时添加细胞因子建立的另一株NK细胞系KAI3(Tsuge,I.et al.Clin Exp Immunol 1999，115,(3),385-392)。日本学者Nagata用来源于鼻T/NK细胞淋巴瘤患者肿瘤组织同时添加高浓度细胞因子的方法建立了NK和T细胞系(Nagata,H.et al.Blood 2001，97,(3),708-713)。应用类似技术，通过纯化的单一类型的淋巴细胞，添加高浓度的细胞因子，有研究人员建立了源于慢性活动性EBV感染患者的NK细胞系、NK和/或T细胞淋巴瘤的NK细胞(Nagata,H.et al.Pathol Int 2001，51,(10),778-785；Zhang,Y.et al.Br J Haematol 2003，121,(5),805-814；Oyoshi,M.K.et al.Am JPathol 2003，162,(5),1629-1638)。纯化某一类群的淋巴细胞需要10mL全血，这对于儿童患者来说不易获得。

由于需要大型精密仪器或昂贵的分选试剂进行选择细胞再进行培养，并使用饲养细胞和昂贵的高浓度的细胞因子，或者较大量的全血，从而使本领域中有报道的NK细胞系和T细胞系不易于建立，限制了相关疾病致病机理的研究、药物筛选工作的进行，以及可能通过基因改造的细胞疗法对此类疾病的治疗应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种无需昂贵设备和高浓度细胞因子的建立NK和/或T细胞系的方法，无需进行外周血淋巴细胞分类，无需饲养细胞，仅添加低剂量的细胞因子即可建成可长期培养的NK和/或T细胞系。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种建立NK和/或T细胞系的方法，其特征在于，采集患者的外周血单个核细胞，在存在细胞因子的条件下，用含有人血清的培养基进行培养；

所述患者为慢性感染性EBV患者，或其他与EBV感染相关的淋巴细胞增殖症、淋巴瘤或白血病患者。