[发明专利]一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法

权利要求书

1.一种测定游离艾塞那肽的方法，其特征在于，所述方法中生物素标记的艾塞那肽与待测样品及标准品中的游离艾塞那肽形成非平衡性的竞争关系，其中待测样品及标准品中的游离艾塞那肽优先进入反应体系的非平衡竞争；所述方法包括以下步骤：

（1）将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；

（2）在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育30～45分钟；

（3）在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；

（4）在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；

（5）在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；所述化学发光底物为SuperSignal^TM ELISA FemtoSubstrate；

（6）将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值以五参数方程拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：

使用碳酸盐缓冲液稀释抗艾塞那肽的抗体溶液到1µg/mL，以每孔100µL以下加入到多孔微孔板中，2～8℃孵育12～24小时；

使用含0.05% 吐温-20的PBS溶液洗板；

加入含3%～5%脱脂牛奶的PBS缓冲液封闭，再使用含0.05%吐温-20的PBS溶液洗板。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗艾塞那肽的抗体为鼠抗艾塞那肽单抗。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述不同浓度的艾塞那肽标准品包括浓度范围9000 pg/mL～4.1 pg/mL内的梯度稀释的5个以上艾塞那肽标准品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述艾塞那肽标准品的浓度梯度分别为9000 pg/mL，3000 pg/mL，1000 pg/mL，333.3 pg/mL，111.1 pg/mL，37.0 pg/mL，12.3 pg/mL，4.1 pg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述艾塞那肽标准品和/或待测样品的基质为缓冲液、细胞培养液、血清中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，加入1:（45000～55000）倍用PBS稀释的生物素标记的艾塞那肽，37℃孵育1～2小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，加入1: （20000～25000）倍用PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育45分钟～1小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，反应1～2分钟后，在425nm的波长下读板以检测化学发光信号值。