[发明专利]一种人Ro52重组蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、人工合成人Ro52基因并亚克隆至原核表达载体得到重组载体；

步骤（2）、将步骤（1）得到的所述的重组载体经转化进入原核表达系统中得到转化子；

步骤（3）、将步骤（2）得到的所述的转化子在培养基中培养得到表达菌；

步骤（4）、将步骤（3）得到的所述的表达菌经亲和层析获得所述的人Ro52重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达载体为pET-28a (+)载体。

3.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达系统为大肠杆菌BL21(DE3)。

4.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用化学转染或物理转染将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。

5.根据权利要求4所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用热激法将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。

6.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用镍柱进行所述的亲和层析。

7.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体实施方式为：根据人Homo sapiens tripartite motif containing 21的mRNA序列，对Ro52全长基因进行原核表达系统密码子优化后由人工直接合成，并亚克隆至原核表达载体得到重组载体。

8.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）的具体实施方式为：将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞冰浴至融化，然后加入所述的重组载体，混合均匀后在冰上放置30min；然后在42℃的水浴中热激90s；再转移至冰浴，放置2min；然后加入LB培养基，在37℃、180 rpm摇床温育1h，使细菌复苏，然后以4000rpm的转速离心3 min，弃去上清得到重组质粒转化产物；将所述的重组质粒转化产物均匀涂布于含有100 µg/mL氨苄西林的LB平板上，倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到所述的转化子，其中，所述的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、所述的重组载体和所述的LB培养基的投料体积比为100：10：500。

9.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）的具体实施方式为：挑取所述的培养皿中的单菌落至含100 mg/mL 氨苄西林的LB培养基中，在37℃、250rpm过夜培养；然后取培养后的菌液至含100 mg/mL 氨苄西林的LB培养基中，在37℃、250rpm的条件下扩大培养至OD600=0.6~1时，加入终浓度为0.05~1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于18~37℃、180 rpm的条件下继续培养诱导3~5h，于10000rpm离心10min，收集菌体得到表达菌。

10.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）的具体实施方式为：将所述的表达菌用细菌裂解缓冲液重悬，重悬后的菌液于冰上用超声破碎仪超声波破碎至半透明；在 9500 rpm、 4℃下离心20min，收集沉淀，将所述的沉淀用含有8M尿素的Binding buffer搅拌溶解，于冰上超声波破碎至半透明，然后用Sigma 3K15离心机以9500 rpm、4℃下离心20min，收集上清液；将Ni-NTA Agarose加入到多聚色谱柱中，用10倍柱床体积的水、5倍柱床体积的Binding Buffer先后洗涤树脂，然后将所述的上清液直接上经处理后的所述的多聚色谱柱；用含有8M的尿素的Washing Buffer洗涤树脂，洗至核酸蛋白检测仪显示蛋白峰降至水平；然后用含有8M的尿素的Eluting Buffer多次将His标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集流出液，直至流出液的吸光度在平稳280 nm基线处，得到所述的人Ro52重组蛋白；其中，所述的表达菌、所述的细菌裂解缓冲液、所述的含有8M尿素的Binding buffer的投料体积比为1000：50：30。