[发明专利]一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备和应用方法

权利要求书

1.一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，其特征为该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球（CS-PEI），表面再修饰有α-丁酮酸，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275 μmol/g，修饰的α-丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860 μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0；

所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：

将CS-PEI微球置于锥形瓶中，加入浓度为0.5～5 g/L的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为80～100 g/L，并用NaOH溶液调节体系pH值为4～6，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30 ℃、转速为120～170 rpm条件下反应6～8 h；再将微球用去离子水，在转速为5000～8000 rpm条件下离心水洗干净后，加入0.5～0.6 g/L NaBH₄溶液，使微球在体系中的浓度为80～100 g/L，并用HCl溶液调节体系pH值为7～8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30 ℃、转速为120～170 rpm条件下反应12～24 h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000～8000 rpm条件下离心水洗，得到α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球（CS-PEI-α-丁酮酸）；

该微球用于辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取，包括如下步骤：

1）确定待复性及吸附提取的蛋白质的等电点值，然后将其与下一步将要使用的复性缓冲液的pH值相比；如果蛋白质的等电点值大于复性缓冲液的pH值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也大于复性缓冲液的pH值的微球；如果蛋白质的等电点值小于复性缓冲液的pH值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也小于复性缓冲液的pH值的微球；

所述的复性缓冲液中含有1～2 mol/L 尿素、20～50 mmol/L Tris–HCl及1～3 mmol/LEDTA，溶剂为去离子水，且pH值为7.0～9.0；

2) 将CS-PEI-α-丁酮酸微球加入到复性缓冲液中，使复性体系中微球浓度为100～150g/L；上述混合物置于空气振荡器中，在温度为25～30 ℃、转速为120～170 rpm条件下振荡预平衡直至温度恒定；然后向其中加入待复性的浓度为10～20 g/L变性蛋白质溶液，使复性体系中蛋白质浓度为0.5～2 g/L；混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为120～170rpm条件下复性3～12 h，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同；

所述的变性蛋白质溶液的制备方法为：将蛋白质溶解于变性缓冲液中，使蛋白质浓度为10～20 g/L，于25～40 ℃变性3～24 h；

所述的变性缓冲液中含有8 mol/L尿素、20～50 mmol/L Tris–HCl及1～3 mmol/LEDTA，溶剂为去离子水，且pH值为7.0～9.0；

3）复性完成后，用0.1～0.5 mol/L的NaOH溶液或0.1～0.5 mol/L的HCl溶液调节上述体系pH值为6.0～10.0，从而将步骤2)中的复性缓冲液变为吸附缓冲液，将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30 ºC、转速为120～170 rpm条件下吸附3～12 h。

2. 如权利要求1所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，其特征为所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的制备方法中，所述的NaOH溶液的浓度为0.1～0.5 mol/L，HCl溶液的浓度为0.1～0.5 mol/L。

3.如权利要求1所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，其特征为所述的辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取中，步骤3)中所述的吸附缓冲液pH值为介于步骤2)中CS-PEI-α-丁酮酸微球的等电点值及蛋白质的等电点值之间的pH值。

4.如权利要求1所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，其特征为所述的辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取中，所述的蛋白质为溶菌酶、牛碳酸酐酶II或重组人γ-干扰素。