[发明专利]一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种重组粉尘螨2类变应原及其编码基因和制备方法，发明人将Der f2基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高Der f2表达的作用原件。经过基因优化后Der f2与现有技术相比具有更高的表达量，且经过本专利纯化工艺获得的重组Der f2与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组粉尘螨2类变应原及其编码基因和表达纯化方法。

背景技术

尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具有较强的变应原型，据统计全球约10％的人口尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起。

目前，临床上主要采用尘螨变应原粗提液治疗尘螨引起的变态反应性疾病，例如2006年上市的浙江我武生物的“畅迪”粉尘螨滴剂即为粉尘螨代谢培养物的提取液。尘螨变应原主要存在于排泄物和螨体中，采用提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高；此外天然变应原提取液的组成非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。长期使用尘螨变应原粗提液易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。

变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗提取液。重组变应原与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白成分单一、具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差；(3)重组变应原与天然提取液相比减少了IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。

尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中1类和2类变应原是最主要的变应原组分。在尘螨过敏患者血清中，70-80％的患者的IgE结合粉尘螨的2类变应原(Der f2)，并呈现强阳性反应。Der f2前体由146个氨基酸组成，经过去除信号肽加工处理后为129个氨基酸，分子量为14KD，无糖基化位点。目前针对Der f2重组表达比较具有代表性的是胡友莹等2011年在原核表达系统中进行的研究，以及2012年崔玉宝等申请的“一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法”(中国专利号：CN102676568A)，但原核表达系统无翻译后修饰的功能，得到的Der f2蛋白结构不正确，与血清反应性较弱，且后期分离纯化困难。

发明内容

为了克服以上缺点，发明人将Der f2基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高Der f2表达的作用原件，发明人惊喜地发现，经过基因优化后Derf2与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。

本发明的一个目的是提供一种编码Der f2蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。该序列针对毕赤酵母表达系统进行了密码子优化，其更利于Der f2在毕赤酵母中表达。

本发明的另一个目的是提供一种Der f2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后Der f2基因的载体，优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZ A、B、C或pGAPZ A、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZ A或pGAPZ A。

本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株，优选的，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H，更优选为KM71或X-33菌株。