[发明专利]聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用，所述聚乙二醇在ADI的1或2个亚基的N端氨基上偶联，所述聚乙二醇分子量为30‑40kDa，聚乙二醇为分支型。本发明提供的聚乙二醇定点修饰的ADI，在具有结构稳定均一等优点的基础上，更大程度的提高了其生物活性。并且，本发明所采用的ADI为基因工程重组表达得到，质量更可控，来源更有保障。这些都使得本发明中的聚乙二醇定点修饰的ADI各方面效果优于目前市场上同类产品，因此本发明的聚乙二醇定点修饰的ADI更具有药用前景及产业化生产可能性。

技术领域

本发明涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和其在药物制备中的应用。

背景技术

精氨酸是人体的一种非必需氨基酸，可以经尿素循环获得，而精氨酸缺陷型肿瘤因缺少ASS(Argininosuccinate Synthetase)所以细胞无法合成精氨酸，因此其生长需要从外部环境中摄取精氨酸。经研究表明，精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,EC3.5.3.6，简称ADI)能够降解环境中的精氨酸，从而抑制这些精氨酸缺陷型肿瘤的生长，达到杀死癌细胞治疗癌症的目的。这种新型的“精氨酸剥夺疗法”可以用于某些精氨酸营养缺陷型癌细胞的治疗，例如肝癌细胞和黑素瘤细胞。

ADI广泛存在于细菌和真核细胞内，自从1933年F.Horn首次报道了绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)中含有ADI后，之后很多来源于不同微生物的ADI相继被报道，包括假单胞菌、支原体、盐杆菌和乳球菌等。来源于不同微生物的ADI在酶活及性质方面差别较大，最适反应pH范围在5.6到7.6之间，大多数在酸性范围内；分子量范围从47kDa到199kDa，多为同源二聚体，部分为同源四聚体；比酶活范围从5.4到140.27U/mg。

自1990年日本和美国的研究机构和公司开始对ADI的抗肿瘤活性进行研究后，ADI作为有效的抗肿瘤药物目前己经进入到临床研究阶段。但ADI的体内半衰期较短，仅为4h左右，美国肯塔基大学和凤凰制药公司的研究人员采用聚乙二醇(SS PEG₂₀₀₀₀)对来源于支原体的ADI进行化学修饰，随后进行体内外抗肿瘤活性试验，成功延长了ADI在小鼠体内的半衰期，并且经过ADI-SS PEG₂₀₀₀₀治疗后，荷瘤小鼠的存活率得到了极大的提高。2009年，美国凤凰公司与北极星集团合作研发了标靶药物ADI-PEG-20，但ADI-PEG-20产品中所使用的PEG是琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)，修饰产物不均一，活性损失较大，含有对酶水解敏感的或者在微碱性PH值时不稳定的酯键(美国专利号4670417)。这些性质显著降低了ADI-PEG-20产品体外和体内的稳定性并且副作用也较大。

目前针对ADI的聚乙二醇修饰研究也有很多。但大部分采用的是PEG对ADI进行随机修饰，修饰ADI赖氨酸残基上的氨基，因此修饰产物不均一，活性损失较大。为了提高修饰产物的活性，有人采用添加保护剂的方法，让保护剂先和ADI的活性中心结合，然后再进行PEG修饰，修饰后再去除结合的保护剂，这种方法制备得到的修饰产物，虽然活性保留较好，但操作步骤繁琐，不适合产业化放大。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术中的上述技术问题，本发明旨在提供稳定性提高、免疫原性降低、组分均一的基础上，也具有高活性的聚乙二醇定点修饰的ADI。

更进一步的说：

本发明的第一目的是提供聚乙二醇定点修饰的ADI，所述聚乙二醇在ADI的1或2个亚基的N端氨基上偶联，所述聚乙二醇分子量为30-40kDa，聚乙二醇为分支型。

优选的，所述聚乙二醇在ADI的2个亚基的N端伯氨基上偶联。

优选的，所述聚乙二醇分子量为30kDa或40kDa。更优选的，所述聚乙二醇优选分子量40KDa。

优选的，聚乙二醇活化基团为醛基。更优选的，活化基团为乙醛、丙醛、丁醛或戊醛。