[发明专利]一种葡甘聚糖酶编码基因及酶和制备与应用

说明书

本发明公开了一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)的葡甘聚糖酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该葡甘聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的葡甘聚糖酶，能高效降解魔芋多糖(又称魔芋葡甘聚糖)。本发明提供的葡甘聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

技术领域

本发明涉及一种葡甘聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了 该葡甘聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发 明提供的葡甘聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领 域。

背景技术

蒟蒻(Amorphophallus konjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植 物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组 成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6 或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊 的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小， 在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目 前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋 主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。

将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjac oligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用 中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜 食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活 性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好 的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌 群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧 化能力等功能。

目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究 期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提 取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此 法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样 生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理 方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于 大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、 易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容 易研究的生产方法。

葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一种能够将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的 酶，根据葡甘聚糖的结构，一般分为两类：葡聚糖酶和甘露聚糖酶，大部分研究 报道的是葡甘聚糖酶的类似酶——甘露聚糖酶。β-1,4-D-甘露聚糖水解酶 (β-1,4-D-mannanmannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一类从甘露聚糖、葡甘露聚糖、 半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链内部随机切割β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的 水解酶，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是降解葡甘露聚糖制备葡甘露寡糖的 有效工具。国内外对甘露聚糖酶的研究多集中于微生物，其中细菌特别是革兰氏 阳性菌包括芽孢杆菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)，真菌中曲霉(Aspergillus) 和里氏木霉(Trichoderma reesei)，放线菌中链霉菌(Streptomyces)研究较多， 但是来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)中的葡甘聚糖酶鲜有报道(仅有四 篇被报道)。目前已报道的葡甘聚糖酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大 规模应用。因此，寻找一种能够高效、稳定降解魔芋多糖的甘露聚糖酶是降低葡 甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于葡甘露聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高葡甘露聚糖酶产量的一种有效措施。

发明内容