[发明专利]一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法

权利要求书

1.一种编辑猪属(Sus)胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法，其包括如下步骤：

1)建立待编辑的猪属胎儿成纤维细胞；

2)确定待编辑的猪属BMPR-IB基因中与羊的BMPR-IB基因746GG相应的位点为746AA；

3)利用CRISPR/Cas系统将所述猪属BMPR-IB基因第746位的碱基AA编辑为碱基AG或GG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas9系统，连接sgRNA之前的质粒载体为PX458。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，在待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体DNA序列中确定CRISPR/Cas9系统中使用的PAM序列，将位于所述PAM序列上游的17至22个碱基确定为编辑BMPR-IB基因第746位碱基的sgRNA，将所述sgRNA连接到所述PX458上，得到PX458-BMPR-IB-746G；优选所述PAM序列为SEQ ID No.2中第1206位至第1208位的GGG；更优选地，所述sgRNA的序列如SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述sgRNA连接到所述PX458上的过程如下：

3-1-I)利用BbsI限制性内切酶对PX458进行线性化，得到线性化的PX458质粒；

3-1-II)设计所述sgRNA的正向引物和反向引物；所述正向引物中含有能够与所述线性化的PX458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端CACC，所述反向引物中含有能够与所述线性化的PX458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端AAAC；将所述正向引物和反向引物退火成双链，得到sgRNA双链片段；

3-1-III)在含有连接酶的体系中将线性化的PX458质粒与sgRNA双链片段进行连接，得到连接产物；

3-1-IV)将所述连接产物转化到感受态大肠杆菌中，筛选出阳性连接产物PX458-BMPR-IB-746G。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，确定与所述PX458-BMPR-IB-746G配合的供体DNA的序列；在所述供体DNA的序列中包含BMPR-IB基因的746G以及sgRNA序列，并且sgRNA序列下游的3个碱基不能为PAM序列，所述供体DNA的其他序列与待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体DNA序列一致；优选所述供体DNA的序列具有300bp至3kb的长度；更优选供体DNA的序列具有500bp至1000bp的长度；最优选所述供体DNA的序列如SEQ IDNo.20所示，其中与所述染色体DNA中的所述PAM序列对应的序列为GGC。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述PX458-BMPR-IB-746G和所述供体DNA序列转染到所述猪属胎儿成纤维细胞中，并筛选BMPR-IB基因的746AA突变为AG杂合子或GG纯合子的阳性克隆，过程如下：

3-2-I)将0至3代的所述猪属胎儿成纤维细胞进行培养，培养液为包括青霉素、链霉素，以及体积含量18％-22％胎牛血清的高糖DMEM；待细胞汇合度达90％以上时，将PX458-BMPR-IB-746G、供体DNA、PX459v2以及DNA连接酶IV抑制剂SCR7混合，并转染猪胎儿成纤维细胞；

3-2-II)利用PCR测序法筛选阳性克隆。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，转染猪胎儿成纤维细胞所用的所述PX458-BMPR-IB-746G、供体DNA和PX459v2的质量比为(1.8-2.2)：(1.8-2.2)：1；优选转染400-600万个猪胎儿成纤维细胞所用的所述PX458-BMPR-IB-746G、供体DNA和PX459v2的用量依次为25μg、25μg，和12.5μg。